造血前駆細胞の機能性を迅速に評価する方法はほとんどありません。このプロトコルは、最初の細胞分裂が細胞の運命とコミットメントに与える影響を測定します。このプロトコルにより、複雑で広範な操作を必要とせずに、単一細胞レベルで高スループットで分裂と分化を同時に測定できます。
この方法は、培養中に維持できるあらゆる造血集団に適しています。そのため、がん生物学、免疫学、発生生物学に簡単に適用できます。まず、250マイクロリットルのCD34+画分を4本の15ミリリットルのポリプロピレンチューブに均等に分注します。
テキスト原稿に記載されているようにチューブにラベルを付けます。250マイクロリットルのCD34フラクションを別の4本の15ミリリットルのポリプロピレンチューブに分注し、チューブにラベルを付けます。CFSE高およびCSFE低溶液をテキスト原稿に記載されているように準備します。
CFおよびCVチューブに250マイクロリットルのCFSE高溶液、VCチューブに250マイクロリットルのCFSE低溶液を、ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)250マイクロリットルをVIチューブに追加します。細胞色素中の細胞懸濁液の効率的な混合を確実にするために、チューブを90度傾け、CFSE溶液をチューブ壁に堆積させます。次に、チューブを垂直に保持し、3〜4回混合して、CFSE溶液と再懸濁された細胞との迅速な混合を確実にします。
懸濁液を摂氏37度で8分間インキュベートします。インキュベーション後、10%FBSを含む5ミリリットルのDMEMを加え、チューブを摂氏37度で5分間置きます。チューブを300 Gで5分間回転させます。
ペレットを乱すことなく吸引によって上清を除去し、5ミリリットルのPBS、ETDAでペレットを洗浄します。チューブを再度回転させ、上清を廃棄してから、ペレットを40マイクロリットルのPBS、ETDAに再懸濁します。CD34+細胞を染色するには、抗体のマスターミックスを1本の0.5ミリリットルチューブに調製します。
抗体マスターミックスから7マイクロリットルを4つのCD34+条件のそれぞれに追加します。CD34+細胞のビーズにはそれぞれ約500マイクロリットル、CD34チューブには1ミリリットルを使用して、細胞を染色バッファーに再懸濁します。セルの並べ替えでは、ドットプロット図を作成してゲーティング戦略を設定します。
まず、FSCA対SSCAドットプロットでセルを視覚化し、ポリゴンゲーティングツールをダブルクリックして、側方散乱の低い母集団を選択します。この新しく作成されたゲートに Cells というラベルを付けます。次のドットプロット、FSCA対FSCHで、プロットを右クリックし、ドロップダウンメニューからゲートセルをクリックして選択します。
同じゲーティングツールを使用して、2つの軸間の対角線上のタイトな母集団を選択します。このゲートに単一セルというラベルを付けます。3番目のドットプロットでは、APC対FSH-Hは、集団単一細胞を表示し、APC系統の発現に対して陰性の細胞をゲートします。
この新しく作成された母集団に [系列] ネガティブというラベルを付けます。4番目のプロットCFSE対CTVでは、母集団系統陰性を表示し、色素の組み合わせごとに1つずつ、合計4つの別々のゲートを作成します。ゲートVIを例として示します。
5番目と6番目のプロットを使用して、目的の先祖を特定します。5番目のプロットでCD34 + CD38集団とCD34 + CD38 +を寛大にゲートします。次に、6番目のプロットでCD34+CD38集団を選択し、LMPP、HSC、およびMPPの3つのゲートを描画します。
CD34+フラクションを実行し、シングルセルゲートに少なくとも5, 000のイベントを記録します。色素の組み合わせごとにゲートを調整し、均質な集団を選択するためにタイトなゲートを設定します。実験ソートレイアウトを使用してプレートソートテンプレートを準備します。
CD34という名前のウェルには、CF、CV、VC、VIゲートでソートされた5, 000〜10, 000個の細胞が含まれています。バルクウェルには、ゲートCD34+CD38でソートされた500個の細胞が含まれています-シングルセルウェルには、ウェルごとに細胞分裂色素の組み合わせごとに1つのイベントしか含まれていないため、ウェルあたり合計4つのイベントが含まれています。次に、CD34-CFを収量純度モードでソートすることから始めます。
[取得]ボタンをクリックしてから、[並べ替え]ボタンをクリックします。[取得] をクリックし、[並べ替え] ボタンをクリックして、純度グレードとして 0160 にチェックマークを付けていることを確認します。最後に、目的の細胞をウェルごとに1つのセルを単一細胞の純度でソートし、[インデックスソート]オプションがオンになっていることを確認します。
プレートを300 Gで5分間遠心分離し、フードの下でプレートをペーパータオルの上で急速に反転させて上清を取り除きます。8マイクロリットルの静置バッファーをウェルA1からA4に加え、続いて8マイクロリットルの混合物を他のウェルに加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100マイクロリットルの染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
遠心分離して上清を除去してから、細胞を85マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁します。専用のテンプレートを使用して取得モードでフローサイトメーターの分析を開始し、カスタムをクリックします。リストから目的の蛍光色素を選択したら、少なくとも1つの細胞を含むウェル数に対して補正したプレートテンプレートに従ってプレートセットアップを設定します。
[攪拌]オプションにチェックマークを付け、取得量制限として100マイクロリットルを選択します。次に、取得速度を毎秒1マイクロリットルに上回らないように設定し、低速では1ウェルあたりの分析総量が改善されます。代表的なゲーティングの場合は、異なるバルクウェルを1つのファイルに連結します。
[母集団の連結]オプションをクリックした後、[パラメータ]メニューから[すべての補正されていないパラメータ]を選択し、[連結]をクリックします。連結されたファイルをワークスペースにアップロードし、ドラッグアンドドロップで補正マトリックスを適用します。CV と VC のセルラベルには、変換された値が必要です。
[ツールとパラメータの派生]をクリックして、変換された値を取得します。指定した数式を数式ボックスに貼り付けます。ヒストグラムプロットとして各色に個別にゲーティングを適用します。
CF と VI の場合は、それぞれ X 軸に CFSE-A と CTV-A を設定します。CVとVCの場合、X軸に新しく導出されたパラメータを設定し、各ピークに対応するゲートを設定します。個々の単一セルウェルにゲーティングを適用します。
解析されたすべてのウェルに派生パラメータを追加してください。各ウェルの各カラーゲートを手動で検証して、特定のピークに誤って割り当てられているイベントを検出します。細胞培養後のフローサイトメトリー解析では、細胞の表現型とともに個々の細胞の親族関係を確立するための正確なゲーティングが必要です。
ピークの定義と割り当ては、フローサイトメトリー解析の重要な側面です。ヒストグラムには、複数のピークに広がるファミリーの 2 つの例、2 つの類似した強度ピークの 1 つ、および 2 つの異なる強度ピークを持つファミリの 2 つの例が表示されます。HSCとMPPについて72時間後に実行された2つの別々の実験について、さまざまな種類のデータ表現と統計的検定がここに示されています。
条件HSC分化のヒートマップは、細胞運命と細胞分裂の両方において、異なる細胞ファミリーを表します。HSCとMPP由来の細胞ファミリーの運命を比較したヒストグラムを以下に示す。両方の細胞タイプについて、条件GTと条件分化の比較が、MPPに対して実行された統計的検定とともに表示されます。
世代ごとの細胞ファミリーの割合と、最初の分裂の運命における対称性または非対称性のタイプを比較するヒストグラムがここに示されています。MPPの世代ごとの運命の分布と条件の差別化を以下に示します。この手順では、適切なゲーティング戦略を設定するために、細胞を一括で分離する必要があります。
したがって、少なくとも10, 000個の細胞で染色を開始することをお勧めします。この方法を生細胞が想像するような連続測定と組み合わせることは、2つを組み合わせることで細胞動態の初期の前駆細胞の詳細な説明を提供できるため、非常に強力です。このアプローチは、ホプキンス研究所によってT細胞生物学のために最初に開発されました。
血液幹細胞に適応したこのバージョンは、現在、癌および幹細胞生物学に拡大しています。
