923 Views
•
10:20 min
•
March 24th, 2023
DOI :
March 24th, 2023
•0:04
Introduction
0:51
Cell Dye Staining
2:33
Antibody Staining and Cell Sorting
5:41
After Culture Antibody Staining
6:47
Post‐Culture Flow Cytometry Data Analysis
8:01
Results: Simultaneous Assessment of Cell Division Number, Surface Cell Phenotype, and Cellular Kinship
9:26
Conclusion
Transcript
Få metoder gör det möjligt att snabbt bedöma funktionaliteten hos hematopoetiska föregångare. Detta protokoll mäter effekterna av de första celldelningarna på cellens öde och engagemang. Detta protokoll gör det möjligt att mäta samtidigt delning och differentiering på encellsnivå och med hög genomströmning utan att kräva komplex och omfattande manipulation.
Denna metod är lämplig för alla hematopoietiska populationer som kan bibehållas i kultur. Så det kan enkelt tillämpas på cancerbiologi, immunologi och utvecklingsbiologi. Till att börja med, alikvot 250 mikroliter av CD34 + fraktion lika i fyra 15 ml polypropenrör.
Märk rören enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Alikvot 250 mikroliter av CD34-fraktionen i ytterligare fyra 15 milliliter polypropenrör och märk rören. Förbered CFSE höga och CSFE låga lösningar enligt beskrivningen i textmanuskriptet.
Tillsätt 250 mikroliter CFSE hög lösning till CF- och CV-röret, 250 mikroliter CFSE låg lösning till VC-röret och 250 mikroliter Dulbeccos modifierade örnmedium, eller DMEM, utan fetalt bovint serum eller FBS, till VI-röret. För att säkerställa en effektiv blandning av cellsuspension i cellfärg, luta röret 90 grader och deponera CFSE-lösningarna på rörväggen. Håll sedan röret vertikalt och blanda tre eller fyra gånger för att säkerställa en snabb blandning av CFSE-lösningarna med de återsuspenderade cellerna.
Inkubera suspensionen vid 37 grader Celsius i åtta minuter. Efter inkubation, tillsätt fem milliliter DMEM innehållande 10% FBS och placera rören vid 37 grader Celsius i fem minuter. Snurra rören vid 300 G i fem minuter.
Ta bort supernatanten via aspiration utan att störa pelleten och tvätta pelleten med fem milliliter PBS, ETDA. Snurra rören igen och kassera supernatanten innan du återsuspenderar pelleten i 40 mikroliter PBS, ETDA. För att färga CD34 + -cellerna, förbered en masterblandning av antikroppar i ett enda 0,5 ml rör.
Tillsätt sju mikroliter från antikroppsmasterblandningen till vart och ett av de fyra CD34+-förhållandena. Resuspendera cellerna i färgningsbuffert med cirka 500 mikroliter vardera för pärlorna i CD34 + celler och en milliliter för CD34-rören. För cellsortering anger du grindstrategin genom att skapa punktdiagram.
Visualisera först cellerna på ett FSCA- kontra SSCA-punktdiagram och dubbelklicka på Polygon-grindverktyget för att välja populationen med låg sidospridning. Märk den här nyskapade grinden som celler. I följande punktdiagram, FSCA kontra FSCH, högerklickar du på diagrammet och väljer grindcellerna i rullgardinsmenyn genom att klicka på det.
Använd samma grindverktyg för att välja en tät population på diagonalen mellan de två axlarna. Märk den här grinden som Enskilda celler. I det tredje punktdiagrammet, APC kontra FSH-H, visas populationens enskilda celler och grindar cellerna negativa för uttryck av APC-härstamning.
Märk den här nyskapade populationen som Lineage Negative. I det fjärde diagrammet, CFSE kontra CTV, visar populationen Lineage Negative och skapar fyra separata grindar, en för varje färgkombination. Gate VI visas här som ett exempel.
Använd den femte och sjätte tomten för att identifiera förfäderna av intresse. Gates generöst CD34 + CD38-befolkning och CD34 + CD38 + i den femte tomten. Välj sedan CD34+CD38-populationen i det sjätte diagrammet och rita tre grindar för LMPP, HSC och MPP.
Kör CD34 + fraktionerna, spela in minst 5 000 händelser i den enda cellporten. Justera grinden för varje färgkombination, ställ in en tät grind för att välja en homogen befolkning. Förbered mallen för sortering av tallrikar med layouten Experimentsortering.
Brunnarna som heter CD34-innehåller 5 000 till 10 000 celler sorterade på CF, CV, VC, VI-porten. Bulkbrunnarna innehåller 500 celler sorterade på grinden CD34 + CD38-De enskilda cellbrunnarna innehåller endast en händelse per celldelningsfärgkombination per brunn, så fyra händelser per brunn totalt. Börja sedan med att sortera CD34-CF i läget Yield Renhet.
Klicka på knappen Hämta och sedan på knappen Sortera. Klicka på Anskaffa och sedan på knappen Sortera och se till att du har markerat 0160 som renhetsgrad. Slutligen sortera cellerna av intresse, en cell per brunn, i renhet med en cell, se till att ha markerat alternativet Indexsortering.
Centrifugera plattan vid 300 G i fem minuter och ta bort supernatanten genom att snabbt vända plattan under huven över en pappershandduk. Tillsätt åtta mikroliter stående buffert till brunnarna A1 till A4, följt av tillsats av åtta mikroliter av blandningen till de andra brunnarna. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 mikroliter färgningsbuffert per brunn med en flerkanalig pipett.
Centrifugera och avlägsna supernatanten innan cellerna suspenderas igen i 85 mikroliter färgningsbuffert. Starta analysen på flödescytometern i förvärvsläge med hjälp av den dedikerade mallen och klicka på Anpassad. När du har valt fluoroforer av intresse från listan, ställ in plattinställningen enligt plattmallen korrigerad för antalet brunnar som innehåller minst en cell.
Markera alternativet Agitation och välj 100 mikroliter som förvärvsvolymgräns. Ställ sedan in förvärvshastigheten som inte överstiger en mikroliter per sekund, eftersom lägre hastighet förbättrar den totala analyserade volymen per brunn. För representativ grind sammanfogar du de olika bulkbrunnarna i en enda fil.
När du har klickat på alternativet Sammanfoga populationer väljer du Alla okompenserade parametrar från menyn Parametrar och klickar sedan på Sammanfoga. Ladda upp den sammanfogade filen till arbetsytan och tillämpa sedan kompensationsmatrisen via dra och släpp. Celletiketter med CV och VC behöver ett transformerat värde.
Klicka på Verktyg och härled parameter för att få det transformerade värdet. Klistra in den angivna formeln i formelrutan. Applicera grinden på varje färg individuellt som ett histogramdiagram.
För CF och VI ställer du in CFSE-A respektive CTV-A på X-axeln. För CV och VC ställer du in den nyligen härledda parametern på X-axeln och ställer sedan in grindar som motsvarar varje topp. Applicera grinden på varje enskild enskild cellbrunn.
Se till att lägga till den härledda parametern i varje analyserad brunn. Kontrollera manuellt varje färggrind för varje brunn för att identifiera händelser som felaktigt tilldelats en viss topp. Flödescytometrianalysen efter cellodling kräver exakt grind för att fastställa släktskapet för varje enskild cell tillsammans med den cellulära fenotypningen.
Peak definition och tilldelning är avgörande aspekter av flödescytometrianalys. Histogrammen visar två exempel på familjer spridda på flera toppar, en av två liknande intensitetstoppar och en med två olika intensitetstoppar. Olika typer av datarepresentation och statistisk testning visas här för två separata experiment som utförs efter 72 timmar för HSC och MPP.
Värmekartan för tillståndet HSC-differentiering representerar olika cellfamiljer, både i cellöden och celldelningar. Histogrammet som jämför ödet HSC och MPP-härledda cellfamiljer visas här. För båda celltyperna visas jämförelsen mellan villkoret GT och villkorsdifferentieringen tillsammans med de statistiska tester som utförts för MPP.
Histogram som jämför procentandelen cellfamiljer per generation och typen av symmetri eller asymmetri i ödet för den första divisionen visas här. Fördelningen av öden per generation för MPP och villkorsdifferentieringen visas här. Denna procedur kräver att isolera celler i bulk för att ställa in lämplig grindstrategi.
Det är därför bättre att starta färgningen med minst 10 000 celler. Att kombinera denna metod med kontinuerlig mätning, som levande celler föreställer sig, kan vara mycket kraftfullt, eftersom de två tillsammans kan ge en detaljerad beskrivning av de tidiga förfäderna till celldynamik. Detta tillvägagångssätt utvecklades först för T-cellbiologi av Hopkins Labs.
Denna version, anpassad för blodstamceller, utvidgas nu till cancer och stamcellsbiologi.
Här presenteras en flödescytometribaserad teknik som möjliggör samtidig mätning av antalet celldelningar, ytcellsfenotyp och cellulärt släktskap. Dessa egenskaper kan testas statistiskt med hjälp av ett permutationsbaserat ramverk.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved