Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV נתמכת על ידי מענק Pedal the Cause של מרכז הסרטן ע"ש אלווין ג'יי סייטמן באמצעות הקרן לבית החולים היהודי בארנס, מענק מחקר פיילוט ממרכז מרשה ריבקין לחקר סרטן השחלות, מענק לחקר הסרטן מקרן Mary Kay Ash וקרן V. NR נתמך על ידי מענק T32 להכשרת תאים וביולוגיה מולקולרית של NIH לאוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס.

הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 2.
1. ציפוי התאים
<ol><li>הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.<ol><li>הוסיפו כיסויים בקוטר ...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב לכלול כמה בקרות ניסיוניות כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. אלה כוללים דגימה ללא טיפול ב- IdU וכן דגימה ללא נוגדנים ראשוניים. שתי הבקרות השליליות אמורות להניב תאים המוכתמים על-ידי DAPI אך אינם מכילים אות IdU.
בהתבסס על תנאי הניסוי וקווי התאים שבהם נעשה שימוש, יי...

דנ"א גנומי חשוף לעתים קרובות להתקפות מרובות ממקורות אנדוגניים ואקסוגניים שונים1. תדירות הנזק האנדוגני נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות תוצרי לוואי מטבוליים, כגון מיני חמצן תגובתי או אלדהידים, שהם גבוהים יותר באופן מהותי בסוגי סרטן מרובים, כולל סרטן השחלות 2,3. הכרחי שנזק לדנ"א ייפתר ביעילות; אחרת, זה יכול לטפח נגעים genotoxic, וכתוצאה מכך, מוטגנזה. יכולתם של תאים לתקן נגעים גנוטוקסיים תלויה בפונקציונליות של מסלולי תיקון דנ"א נטולי שגיאות ובוויסות יעיל של התקדמות מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א. יש לציין כי סרטני שחלות רבים נושאים מוטציות לא פעילות תפקודית ב-p53, ולכן יש להם מחסום G1/S פגום, מה שמוביל את התאים ליזום שכפול DNA למרות נוכחותם של נגעים גנומיים לא מתוקנים 4,5. מידת הנזק לדנ"א בסרטן השחלות מורכבת עוד יותר על ידי התצפית כי ליותר מ -50% מקרצינומת השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה (HGSOC) יש פגמים ברקומבינציה הומולוגית בתיווך BRCA1 ו- BRCA2, מסלול תיקון ה- DNA ללא שגיאות, וכ -20% יש הגברה בגן CCNE1, אשר דוחף בטרם עת תאי G1 לשלב S6 . יחד, התדירות הגבוהה של נזק אנדוגני לדנ"א, נקודות ביקורת פגומות ומסלולי תיקון לא תקינים מגבירים באופן אקספוננציאלי את הצטברות הנגעים הגנומיים בסרטן השחלות. נגעים אלה יכולים לשמש מכשולים להתקדמות של תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול DNA ושעתוק . כפי שיפורט להלן, מכשולים כאלה מזרזים את יצירת הדנ"א החד-גדילי (ssDNA) בתאים.
הסליל הכפול של הדנ"א הוא קריטי להגנה על הגנום מפני תהליכים מוטגניים מרובים, כגון דפורינציה ודפירימידינציה ספונטנית, פעילות של ציטוזין דיאמינאזות, ונזק חמצונילדנ"א 1,7. לעומת זאת, ssDNA פגיע מאוד לאירועים מוטציוניים אלה. תהליכים מרובים בתאים יכולים לגרום ליצירת ssDNA (איור 1). אלה כוללים את הדברים הבאים:
(i) עיכוב של מנגנון שכפול הדנ"א: זה מוביל לניתוק של מנחת המסוקים והפולימראז של הדנ"א, ומשאיר רצועות של ssDNA 8,9.
(ii) עיכוב של מנגנון השעתוק: עיכוב מתמשך של RNA פולימראז מוביל ליצירת מבני DNA/RNA היברידיים תלת-גדיליים הנקראים לולאות R. היווצרות לולאת R חושפת את הדנ"א העקור, שאינו משועתק, כגדיל יחיד10.
(iii) כריתת קצה דנ"א: התחלת תיקון מכוון הומולוגיה דורשת יצירה של ssDNA 3' כדי לזרז את החיפוש אחר רצף הומולוגי11.
(iv) D-loop: פלישת גדיל במהלך רקומבינציה הומולוגית עלולה לגרום לתזוזה של הגדיל המשלים שאינו תבנית, וכתוצאה מכך ssDNA12.
(v) פערים מצומדים לשכפול: במהלך שכפול הדנ"א, סינתזת גדילים מפגרים מתרחשת באופן לא רציף, שבו מקטעי אוקזקי נוצרים תחילה ולאחר מכן קשירה. עיכוב או פגם בעיבוד מקטעי אוקזקי יכול גם לגרום להיווצרות ssDNA. לבסוף, אם מזלג השכפול על גדיל מוביל נתקל בנגע משתהה, DNA פולימראז ופרימאז, PRIMPOL יכול להוביל מחדש את הסינתזה במורד הזרם, ולהשאיר פער ssDNA מאחורי13,14.
ככל הנראה, רוב האירועים האלה מתרחשים כאשר מנגנון שכפול הדנ"א מתמודד עם נגעים גנומיים או במהלך תיקון מצומד שכפול, דבר המצביע על כך שנזק גבוה יותר לדנ"א מוביל לרמות גבוהות יותר של ssDNA. מכיוון שרבים מאירועים אלה קשורים לשכפול, היווצרות ssDNA נחשבת לסמן של "לחץ שכפול" בתאים15,16.
כאן, אנו מתארים בדיקה שניתן להשתמש בה כדי לכמת באופן אמין ssDNA בתאים. הפשטות, יכולת השחזור ויתרונות העלות של גישה זו הופכים אותה למקובלת לשימוש להערכת תגובת השכפול-עקה בתאים. מחקרים חדשים גילו כי רמת ssDNA יכולה גם לנבא תגובות לכימותרפיה, כגון מעכבי אנזימי PARP1/2, ATR וקינאז Wee1 17,18,19,20,21. מעכבים אלה נרדפים במשטר הטיפול של מספר HGSOCs22. לכן, בדיקה זו יכולה להיות גם כלי שימושי לחיזוי תגובות כימותרפיות בתאי סרטן השחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

לחץ שכפול הוא סימן ההיכר של מספר סוגי סרטן השחלות. לחץ שכפול יכול לנבוע ממקורות מרובים, כולל הפסקות דו-גדיליות, התנגשויות שעתוק-שכפול או אונקוגנים מוגברים, וכתוצאה מכך באופן בלתי נמנע יצירת DNA חד-גדילי (ssDNA). כימות ssDNA, אם כן, מהווה הזדמנות להעריך את רמת לחץ השכפול בסוגי תאים שונים ובתנאים או טיפולים שונים הפוגעים בדנ"א. ראיות חדשות מצביעות גם על כך ש- ssDNA יכול להיות מנבא של תגובות לתרופות כימותרפיות המכוונות לתיקון DNA. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת המבוססת על אימונופלואורסנציה לכימות ssDNA. מתודולוגיה זו כוללת תיוג הגנום עם אנלוגי תימידין, ואחריו זיהוי מבוסס נוגדנים של האנלוגי בכרומטין בתנאים שאינם דנטורציה. ניתן לדמיין מתיחות של ssDNA כמוקדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מספר המוקדים ועוצמתם קשורים ישירות לרמת ssDNA הקיימת בגרעין. אנו גם מתארים צינור אוטומטי לכימות אות ssDNA. השיטה מהירה וניתנת לשחזור. יתר על כן, הפשטות של מתודולוגיה זו הופכת אותה למקובלת על יישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון תרופות ובדיקות גנטיות.

תמונות מייצגות וכימות של מוקדי IdU מהגרעינים שמקורם בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו בהידרוקסיוראה של 0.5 מילימטר במשך 24 שעות מוצגים באיור 4. שני הגרעינים מוכתמים וניתנים לזיהוי בערוץ DAPI. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לח?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

הפרוטוקול שלנו מציג שיטה יעילה ביותר וקלה לשחזור לכימות DNA חד-גדילי, המהווה סמן של לחץ שכפול במגוון קווי תאים. בנוסף, הפשטות שלו מאפשרת יישומים ומסכים בעלי תפוקה גבוהה. בפרט, שיטה זו מאפשרת כימות מהיר של לחץ שכפול, סימן היכר של מספר סוגי סרטן השחלות.זה גם מקובל על תוכנת ניתוח אוטומטי המארח, עוד יותר להגדיל את היעילות. דנ"א חד-גדילי נחשב כיום באופן פעיל כסמן ביולוגי לתגובה לכימותרפיה המכוונת למסלולי תיקון DNA. לפיכך, שיטה זו ישימה מאוד בתרחיש זה.עקה שכפול קיימת מעבר להקשרים של סרטן השחלות או BRCA1, סרטן חסר BRCA2. ולכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים אחרים או הקשרים של מחלות. כדי להתחיל, הפוך החלקות כיסוי מצופות פוליליזין על ידי הוספת החלקות כיסוי בקוטר 12 מ"מ ותמיסת פוליליזין לצינור חרוטי 50 מיליליטר, והנח על נדנדה למשך 15 דקות.שאפו את הפתרון על מכסה מנוע של תרבית רקמות. שטפו את החלקות הכיסוי על ידי הוספת מים סטריליים, והניחו את הצינור המכיל את החלקות הכיסוי בחזרה על הנדנדה למשך חמש דקות. לאחר שטיפת הכיסוי מחליקה שלוש פעמים, שאפו מים מהצינור ופזרו את החלקות הכיסוי על כלי סטרילי.שאפו את המים הנותרים ותנו להם להתייבש במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה או עד שלא יישארו טיפות מים. לאחר הייבוש, אוטמים את התבשיל עם פרפילם ומניחים אותו על 4 מעלות צלזיוס. כדי למנוע ניתוק של התאים מחליקי הכיסוי במהלך שלב החילוץ שלפני המיצוי, הניחו פתק כיסוי מצופה פוליליזין אחד בכל באר של צלחת בת 24 בארות.ברגע שתאי OVCAR3 מגיעים למפגש של 70% עד 80%, שאפו את התווך מהצלחת ושטפו את התאים עם 5 עד 7 מיליליטר PBS. שאפו את PBS מהצלחת. לאחר שאיפת PBS, להוסיף 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין ומניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 עד 10 דקות או עד התאים להרים מתחתית הצלחת.לאסוף את התאים עם 5 עד 10 מיליליטר של בינוני ולהוסיף את השעיית התא צינור חרוט. ספור את התאים באופן ידני עם hemocytometer באמצעות הליכים סטנדרטיים. לאחר מכן, לדלל את תרחיף התא, ולקבל מספר שיניב 70 עד 80% מפגש לאחר שלוש אוכלוסיות.הוסף 1 מיליליטר של תרחיף תאים על פתקי כיסוי פוליליזין שהונחו בבארות של צלחת 24 בארות, וגדל את התאים בתווך התרבית בתנאים סטנדרטיים. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, שאפו את המדיה הקיימת מהצלחת ופעמו את התאים עם 10 IdU מיקרומולרי עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות. כדי לקצור את התאים, החליפו את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח על קרח למשך חמש דקות.לקיבוע תאים, יש לשאוף PBSTx ולדגור על התאים במשך 15 דקות עם 3% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש עד ארבע שטיפות עם PBS, יש לשמור על תאים קבועים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך חמש דקות, תוך הקפדה על כיסוי כל חלקת הכיסוי.לאחר שטיפת התאים שלוש עד ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של 0.2% PBST בטמפרטורת החדר, שאפו את ה-PBST וחסמו את הדגימות באמצעות 5% BSA שנעשו ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. עבור immunostaining, להכין תא אחיד על ידי הנחת מגבת נייר רטובה על Tupperware תחתית שטוחה. מכסים את מכסה הצלחת בעל 24 הבארות בפרפילם.הניחו אותו בתא הלח והניחו את פתקי הכיסוי על מכסה הצלחת. הוסף 60 מיקרוליטר של נוגדן עכבר ראשוני מדולל נגד BrdU בחלק העליון של חלקת הכיסוי. לחלופין, כדי להפחית את הנוגדן מהתייבשות ולהשתמש בפחות נפח, הניחו טיפה של נוגדן מדולל על הפרפילם והפכו עליו את החלקת הכיסוי.ואז לדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שואפים את הנוגדן העיקרי. החזירו את פתקי הכיסוי לצלחת בת 24 בארות ושטפו אותם עם 0.2% PBST ארבע פעמים.מוסיפים נוגדן משני מדולל על הכיסוי כפי שהודגם קודם לכן, ודגרים במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר. תייג שקופית מיקרוסקופ והרכיב את החלקת הכיסוי על השקופיות עם אמצעי הרכבה DAPI. אחסנו שקופיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות אם יש צורך לרפא או להקשיח את אמצעי ההרכבה.הגרעינים שמקורם בתאים שלא טופלו וטופלו בהידרוקסיאוריאה של 0.5 מילימולר הוכתמו והיו ניתנים לזיהוי בתעלות DAPI ו-IdU. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לחץ השכפול.חשוב לקחת בחשבון את זמן ההכפלה של קו התאים המועדף מכיוון שזמן פעימת IdU עשוי להשתנות לתקופות הכפלה ארוכות או קצרות יותר. לחלופין, אנו יכולים לחקור תאים עבור חלבון שכפול A כדי לאשר את התוצאות ולהעריך תגובות שונות של עקה שכפול בתאים. טכניקה זו משמשת עבור קווי תאים רבים יחד עם כל גורם נזק לדנ"א כדי לבחון הצטברות של DNA מתוח יחיד.לפיכך, שיטה זו נגישה וישימה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

דוגמנות ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור באמצעות מזרק ומחט

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...