Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV støttes av Inaugural Pedal the Cause Grant av Alvin J. Siteman Cancer Center gjennom The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant fra Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant fra Mary Kay Ash Foundation og V-Foundation. NR støttes av NIH Cell and Molecular Biology training T32 stipend til Washington University, St. Louis.

MERK: Eggstokkreftcellelinjen, OVCAR3, ble brukt i disse trinnene, men denne protokollen er i stor grad anvendelig for flere andre cellelinjer, inkludert de som er avledet fra ikke-eggstokkkilder. Et skjema over protokollen er vist i figur 2.
1. Plettering av cellene
<ol><li>Lag poly-L-lysinbelagte deksler.<ol><li>Legg autoklaverte deksler på 12 mm diameter til et 50 ml konisk rør med poly-L-lysinløsning, og sett på en vippe i 15 minutter.</...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

Som nevnt i protokollen, er det verdifullt å inkludere noen eksperimentelle kontroller for å sikre at analysen fungerer. Disse inkluderer en ingen IdU-behandlet prøve, så vel som en primær antistoffbehandlet prøve. Begge negative kontrollene skal gi celler som er farget av DAPI, men inneholder ikke noe IdU-signal.
Basert på eksperimentelle forhold og cellelinjer som brukes, kan det være nødvendig med forskjellige antistofffortynninger for å oppnå det beste fluorescerende signalet. F...

Genomisk DNA blir ofte utsatt for flere angrep fra ulike endogene og eksogene kilder1. Frekvensen av endogen skade korrelerer direkte med nivåene av metabolske biprodukter, som reaktive oksygenarter eller aldehyder, som er iboende høyere i flere krefttyper, inkludert eggstokkreft 2,3. Det er viktig at DNA-skade løses effektivt; Ellers kan det fremme genotoksiske lesjoner og følgelig mutagenese. Cellens evne til å reparere genotoksiske lesjoner er avhengig av funksjonaliteten til feilfrie DNA-reparasjonsveier og effektiv regulering av cellesyklusprogresjon som respons på DNA-skade. Spesielt har mange eggstokkreft funksjonelt inaktiverende mutasjoner i p53 og har dermed et defekt G1 / S-kontrollpunkt, noe som fører til at cellene starter DNA-replikasjon til tross for tilstedeværelsen av ureparerte genomiske lesjoner 4,5. Graden av DNA-skade i eggstokkreft forsterkes ytterligere av observasjonen at mer enn 50% av høyverdig serøs ovariekarsinom (HGSOC) har defekter i BRCA1- og BRCA2-mediert homolog rekombinasjon, den feilfrie DNA-reparasjonsveien, og rundt 20% har amplifisering i genet CCNE1, som for tidlig skyver G1-celler inn i S-fase6 . Sammen øker den høye frekvensen av endogen DNA-skade, defekte sjekkpunkter og feilfungerende reparasjonsveier eksponentielt akkumuleringen av genomiske lesjoner i eggstokkreft. Disse lesjonene kan tjene som hindringer for utviklingen av kritiske cellulære prosesser som DNA-replikasjon og transkripsjon. Som diskutert nedenfor, katalyserer slike hindringer genereringen av enkeltstrenget DNA (ssDNA) i celler.
Den doble helixen av DNA er kritisk for å beskytte genomet fra flere mutagene prosesser, for eksempel spontan depurinering og depyrimidinering, aktiviteten til cytosindeaminaser og oksidativ DNA-skade 1,7. I motsetning til dette er ssDNA svært sårbart for disse mutasjonshendelsene. Flere prosesser i celler kan resultere i generering av ssDNA (figur 1). Disse inkluderer følgende:
(i) Stopping av DNA-replikasjonsmaskineriet: Dette fører til en frakobling av DNA-helikasen og polymerasen, og etterlater strekninger av ssDNA 8,9.
(ii) Stopping av transkripsjonsmaskineriet: Vedvarende stalling av RNA-polymerase fører til generering av trestrengede hybrid DNA / RNA-strukturer kalt R-sløyfer. R-sløyfeformasjon eksponerer det forskjøvede, ikke-transkriberte DNA som en enkelt streng10.
(iii) DNA-endereseksjon: Initiering av homologirettet reparasjon krever generering av et 3' ssDNA for å katalysere søket etter en homolog sekvens11.
(iv) D-sløyfe: Strandinvasjon under homolog rekombinasjon kan resultere i forskyvning av den ikke-malkomplementære strengen, noe som resulterer i ssDNA12.
(v) Replikasjonskoblede hull: Under DNA-replikasjon skjer forsinket strengsyntese på en diskontinuerlig måte, hvorved Okazaki-fragmenter først genereres og deretter ligeres. En forsinkelse eller defekt i behandlingen av Okazaki-fragmentene kan også resultere i ssDNA-dannelse. Til slutt, hvis replikasjonsgaffelen på en ledende streng møter en stalling lesjon, DNA-polymerase og primase, kan PRIMPOL reprime syntesen nedstrøms, og etterlate et ssDNA-gap bak13,14.
Det er åpenbart at de fleste av disse hendelsene enten skjer når DNA-replikasjonsmaskineriet står overfor genomiske lesjoner eller under replikasjonskoblet reparasjon, noe som tyder på at høyere DNA-skade fører til økte nivåer av ssDNA. Siden mange av disse hendelsene er replikasjonsassosierte, betraktes dannelsen av ssDNA som markøren for "replikasjonsstress" i cellene15,16.
Her beskriver vi en analyse som kan brukes til å kvantifisere ssDNA i celler på en pålitelig måte. Enkelheten, reproduserbarheten og kostnadsfordelene ved denne tilnærmingen gjør den egnet til å brukes til å vurdere replikasjonsstressresponsen i celler. Nye studier har vist at nivået av ssDNA også kan være en prediktor for respons på kjemoterapi, for eksempel hemmere av PARP1/2-enzymer, ATR og Wee1-kinase 17,18,19,20,21. Disse hemmerne forfølges i behandlingsregimet til flere HGSOCs22. Derfor kan denne analysen også være et nyttig verktøy for å forutsi kjemoterapeutiske responser i eggstokkreftceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

Replikasjonsstress er et kjennetegn på flere eggstokkreft. Replikasjonsstress kan dukke opp fra flere kilder, inkludert dobbeltstrengbrudd, transkripsjon-replikasjonskonflikter eller forsterkede onkogener, noe som uunngåelig resulterer i generering av enkeltstrenget DNA (ssDNA). Kvantifisering av ssDNA gir derfor en mulighet til å vurdere nivået av replikasjonsstress i forskjellige celletyper og under forskjellige DNA-skadelige forhold eller behandlinger. Nye bevis tyder også på at ssDNA kan være en prediktor for respons på kjemoterapeutiske legemidler som retter seg mot DNA-reparasjon. Her beskriver vi en detaljert immunfluorescensbasert metodikk for å kvantifisere ssDNA. Denne metoden innebærer merking av genomet med en tymidinanalog, etterfulgt av antistoffbasert deteksjon av analogen ved kromatin under ikke-denaturerende forhold. Strekninger av ssDNA kan visualiseres som foci under et fluorescensmikroskop. Antallet og intensiteten av foci er direkte relatert til nivået av ssDNA tilstede i kjernen. Vi beskriver også en automatisert pipeline for å kvantifisere ssDNA-signalet. Metoden er rask og reproduserbar. Videre gjør enkelheten i denne metoden den mottagelig for applikasjoner med høy gjennomstrømning som narkotika og genetiske skjermer.

Representative bilder og kvantifisering av IdU-foci fra kjernene avledet fra ubehandlede celler og celler behandlet med 0,5 mM hydroksyurea i 24 timer er vist i figur 4. Begge kjernene er farget og identifiserbare i DAPI-kanalen. Analysen av disse bildene består i å kvantifisere antall foci i hver kjerne. Antall foci er proporsjonal med graden av replikasjonsspenning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Her beskriver vi en immunfluorescensbasert metode for å kvantifisere nivåene av enkeltstrenget DNA i celler. Denne effektive og reproduserbare metoden kan brukes til å undersøke replikasjonsstress, et vanlig trekk ved flere eggstokkreft. I tillegg er denne analysen kompatibel med en automatisert analysepipeline, noe som øker effektiviteten ytterligere.

Kvantifisering av replikasjonsstress i eggstokkreftceller ved bruk av enkeltstrenget DNA-immunfluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Vår protokoll presenterer en svært effektiv og lett reproduserbar metode for å kvantifisere enkeltstrenget DNA, som er en markør for replikasjonsstress i en rekke cellelinjer. I tillegg gir enkelheten mulighet for applikasjoner og skjermer med høy gjennomstrømning. Spesielt tillater denne metoden rask kvantifisering av et replikasjonsstress, et kjennetegn ved flere eggstokkreft.Det er også mottagelig for en vert automatisk analyse programvare, ytterligere øke effektiviteten. Enkeltstrenget DNA blir nå aktivt vurdert som en biomarkør for respons på kjemoterapi rettet mot DNA-reparasjonsveier. Derfor er denne metoden svært anvendelig i det scenariet.Replikasjonsstress eksisterer utover eggstokkreft sammenhenger eller BRCA1, BRCA2 mangelfull kreft. Og dermed kan denne metoden brukes på et bredt spekter av andre celletyper eller sykdomskontekster. For å begynne, lage polylysinbelagte dekselslipp ved å legge til autoklaverte 12 millimeter diameter dekselslipp og polylysinløsning til et 50 milliliter konisk rør, og legg på en vippe i 15 minutter.Aspirer løsningen på en vevskulturhette. Vask dekselet ved å legge til sterilt vann, og legg røret som inneholder dekselet glir tilbake på vippen i fem minutter. Etter å ha vasket dekselet tre ganger, aspirer vann fra røret og spred dekselet på en steril tallerken.Aspirer det gjenværende vannet og la dem tørke i vevskulturhetten i en time eller til det ikke er vanndråper igjen. Når det er tørt, forsegl fatet med Parafilm og legg det ved 4 grader Celsius. For å forhindre løsrivelse av cellene fra dekselslippene under pre-ekstraksjonstrinnet, plasser en polylysinbelagt dekselslip i hver brønn på en 24-brønnsplate.Når OVCAR3-cellene når 70 til 80% konfluens, aspirerer mediet fra platen og vasker cellene med 5 til 7 milliliter PBS. Aspirer PBS fra platen. Etter å ha aspirert PBS, tilsett 1 milliliter 0,25% trypsin og legg parabolen i inkubatoren ved 37 grader Celsius i 8 til 10 minutter eller til cellene løfter seg fra bunnen av platen.Samle cellene med 5 til 10 ml medium og legg cellesuspensjonen til et konisk rør. Telle cellene manuelt med et hemocytometer ved hjelp av standardprosedyrer. Deretter fortynner du cellesuspensjonen, og oppnår et tall som vil gi 70 til 80% sammenløp etter tre populasjoner.Tilsett 1 milliliter cellesuspensjon på polylysindekselslipp plassert i brønnene på en 24-brønnsplate, og dyrk cellene i kulturmediet under standardbetingelser. Etter en populasjonsdobling, aspirer de eksisterende mediene fra platen og pulserer cellene med 10 mikromolære IdU for de to påfølgende populasjonsdoblingene. For å høste cellene, erstatt mediet med iskald 0,5% PBSTx på is i fem minutter.For fiksering av celler, aspirer PBSTx og inkuber cellene i 15 minutter med 3% paraformaldehyd ved romtemperatur. Etter tre til fire vasker med PBS, hold faste celler ved 4 grader Celsius til videre bruk. Etter fiksering, permeabiliser cellene med 0,5% PBSTx på is i fem minutter, og sørg for å dekke hele dekselet.Etter å ha vasket cellene tre til fire ganger med 1 milliliter 0,2% PBST ved romtemperatur, aspirer PBST og blokker prøvene med 5% BSA laget i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. For immunfarging, lag et enhetlig kammer ved å legge et vått papirhåndkle på en flatbunnet Tupperware. Dekk til 24-brønns platelokket med Parafilm.Plasser den i det fuktede kammeret og legg ned dekselglippene på platelokket. Tilsett 60 mikroliter fortynnet anti-BrdU primært museantistoff på toppen av dekselet. Alternativt, for å redusere antistoffet fra tørking og bruke mindre volum, plasser en dråpe fortynnet antistoff på Parafilm og vipp dekselet på det.Deretter inkuberes i en time ved 37 grader Celsius. Etter inkubering, aspirer det primære antistoffet. Sett dekselet tilbake på en 24-brønns plate og vask dem med 0,2 % PBST fire ganger.Legg til fortynnet sekundært antistoff på dekselet som vist tidligere, og inkuber i en time i mørket ved romtemperatur. Merk et mikroskoplysbilde og monter dekselet på lysbildene med DAPI-monteringsmedium. Oppbevar lysbilder i mørket ved romtemperatur i 24 timer hvis monteringsmediet må herdes eller herdes.Kjernene avledet fra de ubehandlede og behandlede cellene med 0, 5 millimolar hydroksyurea ble farget og identifiserbar i DAPI- og IdU-kanalene. Analysen av disse bildene består i å kvantifisere antall foci i hver kjerne. Antall foci er proporsjonal med graden av replikasjonsspenning.Det er viktig å vurdere doblingstiden for den valgte cellelinjen, da tiden for IdU-pulsering kan variere i lengre eller kortere doblingsperioder. Alternativt kan vi undersøke celler for replikasjonsprotein A for å bekrefte resultatene og vurdere ulike replikasjonsstressresponser i celler. Denne teknikken brukes til mange cellelinjer sammen med et hvilket som helst DNA-skadeinduserende middel for å undersøke akkumuleringen av enkeltanstrengt DNA.Dermed er denne metoden allment tilgjengelig og anvendelig.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluere In Vitro DNA skade bruk av Comet analysen

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karakterisere DNA reparasjon prosesser på forbigående og lang-varer dobbel-strand DNA bryter av Immunofluorescence mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Modellering av effekten av hemodynamisk stress på sirkulerende tumorceller ved hjelp av en sprøyte og nål

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider via immunfluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...