Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV cuenta con el apoyo de la subvención inaugural Pedal the Cause del Alvin J. Siteman Cancer Center a través de The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant del Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant de Mary Kay Ash Foundation y V-Foundation. NR cuenta con el apoyo de la subvención T32 de capacitación en biología celular y molecular de los NIH a la Universidad de Washington, St. Louis.

NOTA: La línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se utilizó en estos pasos, pero este protocolo es ampliamente aplicable a muchas otras líneas celulares, incluidas las derivadas de fuentes no ováricas. En la figura 2 se muestra un esquema del protocolo.
1. Recubrimiento de las células
<ol><li>Haga cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina.<ol><li>Agregue cubreobjetos de 12 mm de diámetro esterilizados en autoclave a un tubo cónico de ...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

Como se mencionó en el protocolo, es valioso incluir algunos controles experimentales para garantizar que el ensayo esté funcionando. Estos incluyen una muestra no tratada con IdU, así como una muestra no tratada con anticuerpos primarios. Ambos controles negativos deben producir células teñidas por DAPI pero que no contienen señal de IdU.
Según las condiciones experimentales y las líneas celulares utilizadas, se pueden necesitar diferentes diluciones de anticuerpos para obtener la mej...

El ADN genómico está frecuentemente expuesto a múltiples agresiones de diversas fuentes endógenas y exógenas1. La frecuencia de daño endógeno se correlaciona directamente con los niveles de subproductos metabólicos, como especies reactivas de oxígeno o aldehídos, que son intrínsecamente más altos en múltiples tipos de cáncer, incluidos los cánceres de ovario 2,3. Es imperativo que el daño al ADN se resuelva de manera eficiente; de lo contrario, puede fomentar lesiones genotóxicas y, en consecuencia, mutagénesis. La capacidad de las células para reparar lesiones genotóxicas depende de la funcionalidad de las vías de reparación del ADN libres de errores y la regulación eficiente de la progresión del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. Cabe destacar que muchos cánceres de ovario portan mutaciones funcionalmente inactivantes en p53 y, por lo tanto, tienen un punto de control G1/S defectuoso, lo que lleva a las células a iniciar la replicación del ADN a pesar de la presencia de lesiones genómicas no reparadas 4,5. El grado de daño del ADN en los cánceres de ovario se ve agravado por la observación de que más del 50% del carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) tiene defectos en la recombinación homóloga mediada por BRCA1 y BRCA2, la vía de reparación del ADN libre de errores, y alrededor del 20% tiene amplificación en el gen CCNE1, que empuja prematuramente a las células G1 a la fase S6. . En conjunto, la alta frecuencia de daños endógenos en el ADN, los puntos de control defectuosos y el mal funcionamiento de las vías de reparación mejoran exponencialmente la acumulación de lesiones genómicas en los cánceres de ovario. Estas lesiones pueden servir como impedimentos para la progresión de procesos celulares críticos como la replicación y transcripción del ADN. Como se discute más adelante, tales impedimentos catalizan la generación de ADN monocatenario (ssDNA) en las células.
La doble hélice del ADN es crítica para salvaguardar el genoma de múltiples procesos mutagénicos, como la depurinación espontánea y la despirimidinación, la actividad de las citosina desaminasas y el daño oxidativo del ADN 1,7. En contraste, el ssDNA es altamente vulnerable a estos eventos mutacionales. Múltiples procesos en las células pueden resultar en la generación de ssDNA (Figura 1). Entre ellas se incluyen las siguientes:
(i) Estancamiento de la maquinaria de replicación del ADN: Esto conduce a un desacoplamiento de la helicasa del ADN y la polimerasa, dejando tramos de ssDNA 8,9.
(ii) Estancamiento de la maquinaria de transcripción: El estancamiento persistente de la ARN polimerasa conduce a la generación de estructuras híbridas de ADN/ARN de tres cadenas llamadas bucles R. La formación de R-loop expone el ADN desplazado y no transcrito como una sola hebra10.
(iii) Resección final del ADN: El inicio de la reparación dirigida por homología requiere la generación de un 3' ssDNA para catalizar la búsqueda de una secuencia homóloga11.
(iv) D-loop: La invasión de hebras durante la recombinación homóloga puede resultar en el desplazamiento de la cadena complementaria no plantilla, lo que resulta en ssDNA12.
(v) Brechas acopladas a la replicación: Durante la replicación del ADN, la síntesis de hebras rezagadas ocurre de manera discontinua, por lo que los fragmentos de Okazaki se generan primero y luego se ligan. Un retraso o defecto en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki también puede resultar en la formación de ssDNA. Finalmente, si la horquilla de replicación en una hebra principal encuentra una lesión estancada, ADN polimerasa y primasa, PRIMPOL puede reprimir la síntesis aguas abajo, dejando una brecha de ssDNA detrás de13,14.
Evidentemente, la mayoría de estos eventos ocurren cuando la maquinaria de replicación del ADN se enfrenta a lesiones genómicas o durante la reparación acoplada a la replicación, lo que sugiere que un mayor daño en el ADN conduce a un aumento de los niveles de ssDNA. Como muchos de estos eventos están asociados a la replicación, la formación de ssDNA es considerada el marcador de "estrés de replicación" en las células15,16.
Aquí, describimos un ensayo que se puede utilizar para cuantificar de manera confiable ssDNA en las células. La simplicidad, la reproducibilidad y los beneficios de costo de este enfoque lo hacen susceptible de ser utilizado para evaluar la respuesta de estrés de replicación en las células. Los estudios emergentes han revelado que el nivel de ssDNA también puede ser un predictor de respuestas a la quimioterapia, como los inhibidores de las enzimas PARP1/2, ATR y Wee1 quinasa 17,18,19,20,21. Estos inhibidores están siendo perseguidos en el régimen de tratamiento de varios HGSOCs22. Por lo tanto, este ensayo también puede ser una herramienta útil para predecir las respuestas quimioterapéuticas en las células de cáncer de ovario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

El estrés de replicación es un sello distintivo de varios cánceres de ovario. El estrés de replicación puede surgir de múltiples fuentes, incluidas las roturas de doble cadena, los conflictos de transcripción-replicación o los oncogenes amplificados, lo que inevitablemente resulta en la generación de ADN monocatenario (ssDNA). La cuantificación de ssDNA, por lo tanto, presenta una oportunidad para evaluar el nivel de estrés de replicación en diferentes tipos de células y bajo diversas condiciones o tratamientos que dañan el ADN. La evidencia emergente también sugiere que el ssDNA puede ser un predictor de las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a la reparación del ADN. Aquí, describimos una metodología detallada basada en inmunofluorescencia para cuantificar ssDNA. Esta metodología consiste en etiquetar el genoma con un análogo de la timidina, seguido de la detección basada en anticuerpos del análogo en la cromatina en condiciones no desnaturalizantes. Los tramos de ssDNA se pueden visualizar como focos bajo un microscopio de fluorescencia. El número y la intensidad de los focos se relacionan directamente con el nivel de ssDNA presente en el núcleo. También describimos una tubería automatizada para cuantificar la señal de ssDNA. El método es rápido y reproducible. Además, la simplicidad de esta metodología la hace susceptible a aplicaciones de alto rendimiento, como exámenes genéticos y de medicamentos.

En la Figura 4 se muestran imágenes representativas y la cuantificación de focos IdU de los núcleos derivados de las células no tratadas y células tratadas con hidroxiurea de 0,5 mM durante 24 h. Ambos núcleos están teñidos e identificables en el canal DAPI. El análisis de estas imágenes consiste en cuantificar el número de focos en cada núcleo. El número de focos es proporcional al grado de tensión de replicación.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Aquí, describimos un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar los niveles de ADN monocatenario en las células. Este método eficiente y reproducible se puede utilizar para examinar el estrés de replicación, una característica común en varios cánceres de ovario. Además, este ensayo es compatible con una tubería de análisis automatizada, lo que aumenta aún más su eficiencia.

Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Nuestro protocolo presenta un método altamente eficiente y fácilmente reproducible para cuantificar el ADN monocatenario, que es un marcador de estrés de replicación en una variedad de líneas celulares. Además, su simplicidad permite aplicaciones y pantallas de alto rendimiento. En particular, este método permite una cuantificación rápida de un estrés de replicación, un sello distintivo de varios cánceres de ovario.También es susceptible a un software de análisis automático de host, lo que aumenta aún más la eficiencia. El ADN monocatenario ahora se está considerando activamente como un biomarcador para la respuesta a la quimioterapia dirigida a las vías de reparación del ADN. Por lo tanto, este método es altamente aplicable en ese escenario.El estrés de replicación existe más allá de los contextos de cáncer de ovario o BRCA1, cánceres deficientes en BRCA2. Y por lo tanto, este método se puede aplicar a una amplia gama de otros tipos de células o contextos de enfermedades. Para comenzar, haga cubrevestimientos de polilisina agregando cubreobjetos de cubierta de 12 milímetros de diámetro en autoclave y solución de polilisina a un tubo cónico de 50 mililitros, y colóquelos en un balancín durante 15 minutos.Aspirar la solución en una campana de cultivo de tejidos. Lave los cubreobjetos agregando agua estéril y vuelva a colocar el tubo que contiene los resbalones de cobertura en el balancín durante cinco minutos. Después de lavar los resbalones de la cubierta tres veces, aspire agua del tubo y extienda los resbalones de la cubierta en un plato estéril.Aspire el agua restante y déjelos secar en la campana de cultivo de tejidos durante una hora o hasta que no queden gotas de agua. Una vez seco, sella el plato con Parafilm y colócalo a 4 grados centígrados. Para evitar el desprendimiento de las células de los cubreobjetos durante la etapa previa a la extracción, coloque un resbalón de cobertura recubierto de polilisina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.Una vez que las células OVCAR3 alcancen 70 a 80% de confluencia, aspirar el medio de la placa y lavar las células con 5 a 7 mililitros de PBS. Aspire el PBS de la placa. Después de aspirar el PBS, agregue 1 mililitro de tripsina al 0,25% y coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados durante 8 a 10 minutos o hasta que las células se levanten del fondo de la placa.Recoja las celdas con 5 a 10 mililitros de medio y agregue la suspensión celular a un tubo cónico. Contar las células manualmente con un hemocitómetro utilizando procedimientos estándar. A continuación, diluya la suspensión celular y obtenga un número que produzca una confluencia del 70 al 80% después de tres poblaciones.Agregue 1 mililitro de suspensión celular en los cubreobjetos de polilisina colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos y cultive las células en el medio de cultivo en condiciones estándar. Después de duplicar una población, aspirar los medios existentes de la placa y pulsar las células con 10 IdU micromolares para las dos duplicaciones de población posteriores. Para cosechar las células, reemplace el medio con hielo 0.5% PBSTx en hielo durante cinco minutos.Para la fijación de células, aspirar PBSTx e incubar las células durante 15 minutos con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente. Después de tres o cuatro lavados con PBS, mantenga las celdas fijas a 4 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Después de la fijación, permeabilice las células usando 0.5% PBSTx en hielo durante cinco minutos, asegurándose de cubrir todo el cubreobjetos.Después de lavar las células de tres a cuatro veces con 1 mililitro de 0.2% PBST a temperatura ambiente, aspire el PBST y bloquee las muestras usando 5% BSA hecho en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para la inmunotinción, prepare una cámara unificada colocando una toalla de papel húmeda en un Tupperware de fondo plano. Cubra la tapa de la placa de 24 pocillos con Parafilm.Colóquelo en la cámara humidificada y coloque los cubreobjetos en la tapa de la placa. Agregue 60 microlitros de anticuerpo primario de ratón anti-BrdU diluido en la parte superior de la cubierta. Alternativamente, para reducir el secado del anticuerpo y usar menos volumen, coloque una gota de anticuerpo diluido en el Parafilm y voltee el deslizamiento de la cubierta sobre él.Luego incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, aspire el anticuerpo primario. Devuelva los trozos de la cubierta a una placa de 24 pocillos y lávelos con 0.2% PBST cuatro veces.Agregue anticuerpo secundario diluido en la cubierta como se demostró anteriormente, e incube durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Etiquete un portaobjetos de microscopio y monte el deslizamiento de la cubierta en los portaobjetos con el medio de montaje DAPI. Guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas si es necesario curar o endurecer el medio de montaje.Los núcleos derivados de las células no tratadas y tratadas con hidroxiurea 0,5 milimolar se tiñeron e identificaron en los canales DAPI e IdU. El análisis de estas imágenes consiste en cuantificar el número de focos en cada núcleo. El número de focos es proporcional al grado de tensión de replicación.Es importante considerar el tiempo de duplicación de la línea celular de elección, ya que el tiempo de pulsación de IdU puede variar durante períodos de duplicación más largos o más cortos. Alternativamente, podemos sondear las células en busca de la proteína de replicación A para confirmar los resultados y evaluar varias respuestas de estrés de replicación en las células. Esta técnica se utiliza para muchas líneas celulares en conjunto con cualquier agente inductor de daño del ADN para examinar la acumulación de ADN de una sola cepa.Por lo tanto, este método es ampliamente accesible y aplicable.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...