Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV stöds av Inaugural Pedal the Cause Grant av Alvin J. Siteman Cancer Center genom The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant från Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant från Mary Kay Ash Foundation och V-Foundation. NR stöds av NIH Cell and Molecular Biology training T32-bidrag till Washington University, St. Louis.

OBS: Äggstockscancercellinjen, OVCAR3, användes i dessa steg, men detta protokoll är allmänt tillämpligt på flera andra cellinjer, inklusive de som härrör från icke-äggstockskällor. En schematisk bild av protokollet visas i figur 2.
1. Plätering av cellerna
<ol><li>Gör poly-L-lysinbelagda täckglas.<ol><li>Lägg till autoklaverade täckglas med en diameter på 12 mm till ett 50 ml koniskt rör med poly-L-lysinlösning och placera p?...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

Som nämnts i protokollet är det värdefullt att inkludera några experimentella kontroller för att säkerställa att analysen fungerar. Dessa inkluderar ett prov som inte behandlas med IdU samt ett prov som inte behandlas med någon primär antikropp. Båda negativa kontrollerna bör ge celler som färgas av DAPI men som inte innehåller någon IdU-signal.
Baserat på de experimentella betingelserna och cellinjer som används kan olika antikroppsutspädningar behövas för att erhålla den ...

Genomiskt DNA utsätts ofta för flera angrepp från olika endogena och exogena källor1. Frekvensen av endogen skada korrelerar direkt med nivåerna av metaboliska biprodukter, såsom reaktiva syreradikaler eller aldehyder, som i sig är högre i flera cancertyper, inklusive äggstockscancer 2,3. Det är absolut nödvändigt att DNA-skador löses effektivt. Annars kan det främja genotoxiska lesioner och följaktligen mutagenes. Cellernas förmåga att reparera genotoxiska lesioner är beroende av funktionaliteten hos felfria DNA-reparationsvägar och effektiv reglering av cellcykelprogression som svar på DNA-skador. Noterbart är att många äggstockscancer har funktionellt inaktiverande mutationer i p53 och har därmed en defekt G1 / S-kontrollpunkt, vilket leder cellerna att initiera DNA-replikation trots närvaron av oreparerade genomiska lesioner 4,5. Graden av DNA-skador i äggstockscancer förvärras ytterligare av observationen att mer än 50% av högkvalitativt seröst äggstockscancer (HGSOC) har defekter i BRCA1- och BRCA2-medierad homolog rekombination, den felfria DNA-reparationsvägen och cirka 20% har amplifiering i genen CCNE1, som för tidigt skjuter G1-celler in i S-fas6 . Tillsammans ökar den höga frekvensen av endogena DNA-skador, defekta kontrollpunkter och felaktiga reparationsvägar exponentiellt ackumuleringen av genomiska lesioner vid äggstockscancer. Dessa lesioner kan fungera som hinder för utvecklingen av kritiska cellulära processer såsom DNA-replikation och transkription. Som diskuteras nedan katalyserar sådana hinder genereringen av enkelsträngat DNA (ssDNA) i celler.
DNA:s dubbelhelix är avgörande för att skydda genomet från flera mutagena processer, såsom spontan depurination och depyrimidination, cytosindeaminasernas aktivitet och oxidativ DNA-skada 1,7. Däremot är ssDNA mycket sårbart för dessa mutationshändelser. Flera processer i celler kan resultera i generering av ssDNA (figur 1). Dessa inkluderar följande:
i) DNA-replikationsmaskineriet avstannar: Detta leder till att DNA-helikasen och polymeraset kopplas bort, vilket lämnar sträckor av ssDNA 8,9.
ii) Stopp av transkriptionsmaskineriet: Ihållande stopp av RNA-polymeras leder till generering av tresträngade hybrid-DNA/RNA-strukturer som kallas R-loopar. R-loopbildning exponerar det förskjutna, icke-transkriberade DNA som en enda sträng10.
(iii) DNA-slutresektion: Initieringen av homologiriktad reparation kräver generering av ett 3'-ssDNA för att katalysera sökandet efter en homolog sekvens11.
(iv) D-loop: Stränginvasion under homolog rekombination kan resultera i förskjutning av den icke-mallkomplementära strängen, vilket resulterar i ssDNA12.
(v) Replikationskopplade luckor: Under DNA-replikation sker eftersläpande strängsyntes på ett diskontinuerligt sätt, varigenom Okazaki-fragment först genereras och sedan ligeras. En fördröjning eller defekt i bearbetningen av Okazaki-fragmenten kan också resultera i ssDNA-bildning. Slutligen, om replikationsgaffeln på en ledande sträng stöter på en stallande lesion, DNA-polymeras och primas, kan PRIMPOL återuppliva syntesen nedströms och lämna ett ssDNA-gap bakom13,14.
Uppenbarligen inträffar de flesta av dessa händelser antingen när DNA-replikationsmaskineriet står inför genomiska lesioner eller under replikationskopplad reparation, vilket tyder på att högre DNA-skador leder till ökade nivåer av ssDNA. Eftersom många av dessa händelser är replikationsassocierade anses bildandet av ssDNA vara markören för "replikationsstress" i cellerna15,16.
Här beskriver vi en analys som kan användas för att tillförlitligt kvantifiera ssDNA i celler. Enkelheten, reproducerbarheten och kostnadsfördelarna med detta tillvägagångssätt gör det möjligt att användas för att bedöma replikations-stressresponsen i celler. Nya studier har visat att nivån av ssDNA också kan vara en prediktor för svar på kemoterapi, såsom hämmare av PARP1/2-enzymer, ATR och Wee1-kinas 17,18,19,20,21. Dessa hämmare eftersträvas i behandlingsregimen för flera HGSOCs22. Därför kan denna analys också vara ett användbart verktyg för att förutsäga kemoterapeutiska svar i äggstockscancerceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

Replikationsstress är ett kännetecken för flera äggstockscancer. Replikationsstress kan uppstå från flera källor, inklusive dubbelsträngsbrott, transkriptionsreplikationskonflikter eller förstärkta onkogener, vilket oundvikligen resulterar i generering av enkelsträngat DNA (ssDNA). Kvantifiering av ssDNA ger därför en möjlighet att bedöma nivån av replikationsstress i olika celltyper och under olika DNA-skadliga tillstånd eller behandlingar. Nya bevis tyder också på att ssDNA kan vara en prediktor för svar på kemoterapeutiska läkemedel som riktar sig mot DNA-reparation. Här beskriver vi en detaljerad immunofluorescensbaserad metod för att kvantifiera ssDNA. Denna metod innefattar märkning av genomet med en tymidinanalog, följt av antikroppsbaserad detektion av analogen vid kromatin under icke-denatureringsförhållanden. Sträckor av ssDNA kan visualiseras som foci under ett fluorescensmikroskop. Antalet och intensiteten hos foci samverkar direkt med nivån av ssDNA närvarande i kärnan. Vi beskriver också en automatiserad pipeline för att kvantifiera ssDNA-signalen. Metoden är snabb och reproducerbar. Dessutom gör enkelheten i denna metod den mottaglig för applikationer med hög genomströmning som läkemedel och genetiska skärmar.

Representativa bilder och kvantifiering av IdU-foci från kärnorna härledda från obehandlade celler och celler behandlade med 0,5 mM hydroxiurea under 24 timmar visas i figur 4. Båda kärnorna är färgade och identifierbara i DAPI-kanalen. Analysen av dessa bilder består av att kvantifiera antalet foci i varje kärna. Antalet foci är proportionellt mot graden av replikeringsstress.
<img alt="Figure 1" class="xfigim...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Här beskriver vi en immunofluorescensbaserad metod för att kvantifiera nivåerna av enkelsträngat DNA i celler. Denna effektiva och reproducerbara metod kan användas för att undersöka replikationsstress, ett vanligt inslag i flera äggstockscancerformer. Dessutom är denna analys kompatibel med en automatiserad analyspipeline, vilket ytterligare ökar dess effektivitet.

Kvantifiering av replikationsstress i äggstockscancerceller med hjälp av enkelsträngad DNA-immunofluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Vårt protokoll presenterar en mycket effektiv och lätt reproducerbar metod för att kvantifiera enkelsträngat DNA, vilket är en markör för replikationsstress i en mängd olika cellinjer. Dessutom möjliggör dess enkelhet applikationer och skärmar med hög genomströmning. I synnerhet möjliggör denna metod snabb kvantifiering av en replikationsstress, ett kännetecken för flera äggstockscancerformer.Det är också mottagligt för en värd automatisk analysprogramvara, vilket ytterligare ökar effektiviteten. Enkelsträngat DNA betraktas nu aktivt som en biomarkör för svar på kemoterapi som riktar sig mot DNA-reparationsvägar. Därför är denna metod mycket tillämplig i det scenariot.Replikationsstress finns bortom äggstockscancersammanhang eller BRCA1, BRCA2-bristfälliga cancerformer. Och därmed kan denna metod tillämpas på ett brett spektrum av andra celltyper eller sjukdomssammanhang. För att börja, gör polylysinbelagda täckglas genom att lägga till autoklaverade 12 millimeter diameter täckglas och polylysinlösning till ett 50 ml koniskt rör och placera på en vippa i 15 minuter.Aspirera lösningen på en vävnadsodlingshuva. Tvätta locket genom att tillsätta sterilt vatten och placera röret som innehåller locket glider tillbaka på vippan i fem minuter. Efter tvättning glider locket tre gånger, aspirera vatten från röret och sprid locket på en steril skål.Aspirera det återstående vattnet och låt dem torka i vävnadsodlingshuven i en timme eller tills inga vattendroppar finns kvar. När den är torr, försegla skålen med Parafilm och placera den vid 4 grader Celsius. För att förhindra att cellerna lossnar från täcket glider under förextraktionssteget, placera en polylysinbelagd täckslip i varje brunn på en 24-brunnsplatta.När OVCAR3-cellerna når 70 till 80% sammanflöde, aspirera mediet från plattan och tvätta cellerna med 5 till 7 ml PBS. Aspirera PBS från plattan. Efter aspirering av PBS, tillsätt 1 ml 0,25% trypsin och placera skålen i inkubatorn vid 37 grader Celsius i 8 till 10 minuter eller tills cellerna lyfter av från botten av plattan.Samla cellerna med 5 till 10 ml medium och tillsätt cellsuspensionen till ett koniskt rör. Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer med hjälp av standardprocedurer. Därefter späd cellsuspensionen och få ett tal som ger 70 till 80% sammanflöde efter tre populationer.Tillsätt 1 ml cellsuspension på polylysintäckplåtar placerade i brunnarna på en 24-brunnsplatta och odla cellerna i odlingsmediet under standardförhållanden. Efter en befolkningsfördubbling, aspirera det befintliga mediet från plattan och pulsera cellerna med 10 mikromolar IdU för de två efterföljande befolkningsfördubblingarna. För att skörda cellerna, ersätt mediet med iskall 0,5% PBSTx på is i fem minuter.För fixering av celler, aspirera PBSTx och inkubera cellerna i 15 minuter med 3% paraformaldehyd vid rumstemperatur. Efter tre till fyra tvättar med PBS, håll fasta celler vid 4 grader Celsius tills vidare användning. Efter fixering, permeabilisera cellerna med 0,5% PBSTx på is i fem minuter, se till att täcka hela täckglaset.Efter tvättning av cellerna tre till fyra gånger med 1 milliliter 0,2% PBST vid rumstemperatur, aspirera PBST och blockera proverna med 5% BSA gjord i PBS i 30 minuter vid rumstemperatur. För immunfärgning, förbered en enhetlig kammare genom att lägga en våt pappershandduk på en platt botten Tupperware. Täck locket på plattan med 24 brunnar med Parafilm.Placera den i den fuktade kammaren och lägg ner lockplåtarna på plattlocket. Tillsätt 60 mikroliter utspädd anti-BrdU primär musantikropp på toppen av locket. Alternativt, för att minska antikroppen från torkning och använda mindre volym, placera en droppe utspädd antikropp på Parafilm och vänd locket på den.Inkubera sedan i en timme vid 37 grader Celsius. Efter inkubation, aspirera den primära antikroppen. Sätt tillbaka locket på en platta med 24 brunnar och tvätta dem med 0,2 % PBST fyra gånger.Tillsätt utspädd sekundär antikropp på täckglaset som visats tidigare och inkubera i en timme i mörkret vid rumstemperatur. Märk ett mikroskopglas och montera lockslipen på objektglasen med DAPI-monteringsmedium. Förvara glas i mörker vid rumstemperatur i 24 timmar om monteringsmediet behöver härdas eller härdas.Kärnorna härrörande från de obehandlade och behandlade cellerna med 0,5 millimolär hydroxiurea färgades och identifierades i DAPI- och IdU-kanalerna. Analysen av dessa bilder består av att kvantifiera antalet foci i varje kärna. Antalet foci är proportionellt mot graden av replikeringsstress.Det är viktigt att överväga fördubblingstiden för den valda cellinjen eftersom tiden för pulsering av IdU kan variera under längre eller kortare fördubblingsperioder. Alternativt kan vi sondera celler för replikationsprotein A för att bekräfta resultaten och bedöma olika replikationsstressresponser i celler. Denna teknik används för många cellinjer tillsammans med något DNA-skadeinducerande medel för att undersöka ackumuleringen av enkelansträngt DNA.Således är denna metod allmänt tillgänglig och tillämplig.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Utvärdera In Vitro DNA-skador med komet-analys

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering av tumörceller med hjälp av en medicinsk tråd för att fånga cirkulerande tumörceller: en 3D strategi baserad på immunofluorescens och DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karaktärisera DNA reparationsprocesser vid övergående och långvarig dubbel-strand DNA raster med hjälp av immunofluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens imaging av DNA-skador och reparation foci i mänskliga kolon cancerceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Modellering av effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller med en spruta och nål

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering och odling av höggradig serös äggstockscancer patient-derived organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller hos möss rekapitulerar avancerad kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisera DNA-skador reparera proteiner i patient-derived äggstockscancer organoider via immunofluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...