Name: measuring local tissue strains in tendons via open-source digital image correlation
Uploaded: 2023-01-27T14:30:00
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この研究は、国立衛生研究所(R21 AR079095)と国立科学財団(2142627)によって資金提供されました。

この研究は、ペンシルベニア州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.ティッシュの準備
<ol><li>このプロトコルでは、生後2〜4か月のオスのC57BL / 6マウスからアキレス腱を採取します。 注:マウスや他の小動物とは異なる腱や靭帯を使用することもできます。<ol><li>アキレス腱の表在性皮膚を切開して、足底腱と周囲の結合組?...

<ol>
	<li>Devkota, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributing+a+fixed+amount+of+cyclic+loading+to+tendon+explants+over+longer+periods+induces+greater+cellular+and+mechanical+responses.">Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses.</a> Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).</li><li>Sun, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle-dependent+matrix+remodeling+gene+expression+response+in+fatigue-loaded+rat+patellar+tendons.">Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).</li><li>Shepherd, J. H., Screen, H. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatigue+loading+of+tendon.">Fatigue loading of tendon.</a> International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 260-270 (2013).</li><li>Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+as+both+the+cause+and+the+cure+of+tendon+and+ligament+injuries.">Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries.</a> Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 359-386 (2022).</li><li>Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotator+cuff+tendon+strain+correlates+with+tear+propagation.">Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation.</a> Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).</li><li>Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+micro-structural+strain+response+of+tendon.">The micro-structural strain response of tendon.</a> Journal of Materials Science. 42 (21), 8957-8965 (2007).</li><li>Luyckx, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+correlation+as+a+tool+for+three-dimensional+strain+analysis+in+human+tendon+tissue.">Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).</li><li>Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cell-matrix+mechanics+in+tendon+fascicles+and+seeded+collagen+gels:+Implications+for+the+multiscale+design+of+biomaterials.">In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials.</a> Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).</li><li>Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cell+nucleus+deformation+in+tendons+under+tensile+load;+A+morphological+analysis+using+confocal+laser+microscopy.">In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy.</a> Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).</li><li>Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+strain+measurement+within+tendon.">Local strain measurement within tendon.</a> Strain. 40 (4), 157-163 (2004).</li><li>Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+image+analysis+methods+for+quantification+of+in+situ+3-D+tendon+cell+and+matrix+strain.">Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain.</a> Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).</li><li>Yang, J., Bhattacharya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+Lagrangian+digital+image+correlation.">Augmented Lagrangian digital image correlation.</a> Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).</li><li>Peterson, B. E., Szczesny, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+tendon+multiscale+mechanics+on+sample+gauge+length+is+consistent+with+discontinuous+collagen+fibrils.">Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils.</a> Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Biomechanics. , (2015).</li><li>Reese, S. P., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+fascicles+exhibit+a+linear+correlation+between+Poisson's+ratio+and+force+during+uniaxial+stress+relaxation.">Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).</li><li>Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+poroelastic+finite+element+and+shear-lag+models+of+tendon+predict+large+strain+dependent+Poisson's+ratios+and+fluid+expulsion+under+tensile+loading.">Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading.</a> Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).</li><li>Szczesny, S. E., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfibrillar+shear+stress+is+the+loading+mechanism+of+collagen+fibrils+in+tendon.">Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon.</a> Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).</li><li>Han, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-+to+microscale+strain+transfer+in+fibrous+tissues+is+heterogeneous+and+tissue-specific.">Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific.</a> Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).</li><li>Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+open-source,+low-cost+bioreactor+for+load-controlled+cyclic+loading+of+tendon+explants.">A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).</li><li>Gatt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Poisson's+ratios+in+tendons:+An+unexpected+mechanical+response.">Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response.</a> Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).</li></ol>

この論文の目的は、引張荷重下で腱の2Dひずみ場を測定するためのオープンソースの検証済み方法を提供することでした。ソフトウェアの基礎は、公開されているALDICアルゴリズム12に基づいていました。このアルゴリズムは、インクリメンタル(累積)ひずみ解析の機能が追加され、より大きなMATLABコードに埋め込まれました。次に、この適応アルゴリズムを腱の引張試験に?...

腱は、機械的負荷に応答して適応および変性する機械感受性組織です1,2,3,4。腱細胞の生物学において機械的刺激が果たす役割のために、腱細胞が負荷中に天然の組織環境で経験する株を理解することに大きな関心があります。腱の局所組織株を測定するために、いくつかの実験的および分析的技術が開発されている。これらには、スペックルパターンまたはフォトブリーチングライン(PBL)のいずれかを使用した表面ひずみの2D/3Dデジタル画像相関(DIC)分析5,6,7,8、組織内の個々の核の重心間距離の変化の測定9,10、および面外運動と3D変形を考慮した最近のフルフィールド3D DIC法が含まれます11.しかし、これらの手法の精度や感度はごくわずかしか報告されておらず、いずれも公開されていないため、普及・活用は困難である。
この研究の目的は、腱外植片の局所組織株を測定するための検証済みの分析ツールを作成することでした。選択された方法は、YangとBhattacharya12によって開発されたMATLABで書かれた公開されている拡張ラグランジュデジタル画像相関(ALDIC)アルゴリズムに基づいています。このアルゴリズムは、腱サンプルの分析に適合し、デジタル変換された画像に適用し、実際の腱サンプルで測定されたひずみを光退色の線から得られた結果と比較することによって検証されました。さらに、既知のひずみ値や二次測定技術がない場合でも、計算された変位場の精度を確認するための追加機能がアルゴリズムに実装されました。したがって、このアルゴリズムは、腱の局所2D組織ひずみを正確に測定するための非常に有用で適応性のあるツールです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-196-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Coning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile Loading Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring local tissue strains in tendons via open-source digital image correlation

腱細胞がその 場で 経験する株と、これらの株が組織のリモデリングにどのように影響するかを理解することには、かなりの科学的関心があります。この関心に基づいて、負荷中に腱外植片内の局所組織株を測定するためのいくつかの分析技術が開発されてきた。ただし、いくつかのケースでは、これらの手法の精度と感度は報告されておらず、どのアルゴリズムも公開されていません。これにより、腱の外植片における局所組織株のより広範な測定が困難になりました。したがって、この論文の目的は、腱外植片の局所組織株を測定するための検証済みの分析ツールを作成することでした。具体的には、公開されている拡張ラグランジュデジタル画像相関(ALDIC)アルゴリズムを、一軸張力下でマウスアキレス腱内の細胞核の変位を追跡することにより、2D株を測定するために適合されました。さらに、計算されたひずみの精度は、デジタル変換された画像を分析することによって、および株を独立した技術(すなわち、光漂白線)から決定された値と比較することによって検証されました。最後に、計算された変位場を使用して参照画像を再構築する手法がアルゴリズムに組み込まれ、既知のひずみ値がない場合のアルゴリズムの精度を評価するために使用できる、または二次測定技術。このアルゴリズムは、0.00015の精度で最大0.1のひずみを測定できます。再構成された参照画像と実際の参照画像を比較する手法は、誤ったデータを持つサンプルを特定することに成功し、良好なデータを持つサンプルでは、変位場の約85%が正確であることを示しました。最後に、マウスのアキレス腱で測定された株は、以前の文献と一致していました。したがって、このアルゴリズムは、腱の局所組織ひずみを正確に測定するための非常に有用で適応性のあるツールです。

実際の組織サンプルのひずみ場を分析する前に、ALDICプロトコルは、マウスのアキレス腱内の核のデジタルひずみ/変換画像を使用して最初に検証されました。具体的には、画像をデジタル変換して、シミュレートされたポアソン比1 15,16で、x方向に2%、4%、6%、8%、および10%の均一なひずみを生成します。次に、ALDICアルゴリズムの精度は、計算され?...

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Measuring Local Tissue Strains in Tendons via Open-Source Digital Image Correlation

この論文では、腱の外植片内の局所的な2D組織ひずみを測定するためのオープンソースのデジタル画像相関アルゴリズムについて説明します。この手法の精度は、複数の手法を使用して検証されており、一般に利用できます。

オープンソースのデジタル画像相関 による 腱の局所組織ひずみの測定

There is considerable scientific interest in understanding the strains that tendon cells experience in situ and how these strains influence tissue ...

このプロトコルにより、負荷時に腱内の局所組織株の測定が可能になります。腱が機械的にどのように振る舞い、それらの負荷環境に適応するかを理解することは有用です。この技術の主な利点は、使用されるソフトウェアがオンラインで公開されており、真の組織株が不明な場合でも測定精度に関するフィードバックを提供することです。腱の局所組織ひずみを測定することは、腱の変性と修復中に細胞がどのように組織をリモデリングするかを理解するのに役立ちます。この手順を実演するのは、学部生のスタントン・ゴッドシャルと、私の研究室の博士課程の学生であるクリシュナ・ペダプロルです。採取したアキレス腱をDTAFで染色した後、組織をDTAF溶液からDRAQ5溶液に移し、暗空間で室温で10分間インキュベートします。腱を引張荷重装置のグリップに配置します。グリップをローディングデバイスに取り付ける前に、デジタルノギスを使用して、踵骨アタッチメントと反対側のグリップの間の距離を測定します。グリップをPBSを含むローディングデバイスに取り付けて、組織の水分補給を維持します。アルゴリズムのX株とY株の出力が腱軸と一致するように、腱を顕微鏡画像のx軸またはy軸のいずれかにできるだけ合わせます。腱に1グラムの張力をかけます。必要に応じて、組織の中心領域で80ミクロン間隔で4本の線のセットを光退色し、グリップの近くの左右の両端でこのプロセスを繰り返します。各組織領域の線間の距離の変化は、データを検証するために使用できる局所組織株の二次測定値です。次に、共焦点顕微鏡を使用して、1グラムの予負荷でのDTAFおよびDRAQ5蛍光の体積画像を取得します。毎秒0.5%で2%ひずみまでのひずみランプを実行します。ひずみ速度と増分ひずみの大きさは調整できることに注意してください。組織を10分間ストレスリラックスさせた後、変形後の組織の別の体積画像を撮影します。必要な数のひずみ増分に対してこのプロセスを繰り返します。デジタル変換された画像を作成するには、コード digital_strainをダウンロードします。mはGitHubから。ダウンロード後、コードを開いて実行します。プロンプトが表示されたら、OKを押す前に、最大適用ひずみ、適用ひずみ増分、およびポアソン比に必要な値を挿入します。次に、再度プロンプトが表示されたら、変形していない参照画像を選択します。ひずみ増分ごとに、参照画像と変換後の画像のオーバーレイが表示されます。デジタル変換された画像は、デジタル変換されたXパーセントひずみ(Xはひずみ増分)という名前のディレクトリに保存されます。表示された名前のスクリプトを開き、[実行] をクリックして画像解析を開始します。プロンプトが表示されたら、必要に応じて拡張ラグランジュデジタル画像相関またはALDICパラメータの値を変更します。プロンプトが表示されたら、yesチェックボックスを選択して、目的の変数コレクションの平均値、標準偏差、および2Dマップを自動的に保存します。プロンプトが表示されたら、Xひずみ、Yひずみ、せん断ひずみ、不良領域などの目的の変数を選択し、[OK]を押します。次のプロンプトに従って、名前を変更した最大強度 Z 投影を含むフォルダを選択します。ソフトウェアは自動的にインクリメンタルALDICを実行して、変形画像のひずみ場を決定します。プロンプトが表示されたら、左クリックして 4 点ポリゴンを作成し、ひずみを測定するための関心領域を定義します。フォルダ核追跡結果は、行555と556を調整することによって名前を変更することができ、以前に指定されたすべてのプロットを格納します。このフォルダーには、前に指定したすべての平均と標準偏差を格納する results という名前のスプレッドシートも含まれています。デジタル歪み画像を使用して検証した場合、ALDICアルゴリズムは一貫して平均Xひずみを過小評価し、誤差の大きさは加えられたひずみの増加とともに増加しました。Y株もほとんど過小評価されていました。しかし、いずれの場合も、ひずみ誤差の大きさは非常に小さかった。計算されたXひずみとYひずみの標準偏差は、大きさは低いものの、適用ひずみの増加とともに増加した。不良領域解析の結果、累積法で解析したデジタル変換画像において、ひずみ計算が無効である不良領域の数は、ひずみを6%印加した後も一貫して増加し、増分量は1%のままであった。 外れ値として扱われた4つのサンプルのうち1つでは、最大ひずみ増分で画像のほぼ半分が不良であると識別されました。ALDICによって計算されたX株は、PBLから決定されたものよりも大きく、差は0.005以内であり、これはすべてのサンプルで平均化されたPBLデータの標準偏差と同様でした。引張荷重を受けた腱の局所ひずみの大きさと空間分布を決定すると、すべてのサンプルで、Xひずみは一貫して適用されたひずみを下回っていることが示されました。Y方向の平均ひずみはすべての増分でほぼゼロでしたが、標準偏差は高かったです。平均せん断ひずみは、ひずみ増分全体にわたって着実に増加しました。覚えておくべき最も重要な点は、より大きなひずみを加える前に画像を保存することです。保存しないと、イメージは失われ、復元できません。この技術は、腱内の組織ひずみを測定するために特別に検証されていますが、他の多くの動物および人間の組織の機械的生物学および力学への洞察を提供することができます。

Research

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