Primat-IPSC-er er nyttige, men ofte vanskelige å få tak i på grunn av etiske og tekniske problemer. Denne protokollen gir en mest mulig tilgjengelig vei til generering og vedlikehold av primat-IPSC-er. Bruken av urinceller som en primær kilde til IPSC har en stor fordel, da de kan oppnås på en helt ikke-invasiv måte uten spesielle teknikker.
Demonstrere prosedyren vil være Jessica Radmer, en doktorgradsstudent fra Wolfgang MS Laboratory. For å begynne, sentrifuger det urinholdige røret ved 400G i 10 minutter. Deretter aspirerer supernatanten forsiktig, etterlater omtrent en milliliter i røret og resuspenderer pelleten i den.
Vask cellene ved å tilsette 10 ml urinvaskebuffer inneholdende amfotericin og bland suspensjonen forsiktig med en serologisk pipette. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig, og etterlater omtrent mindre enn 0, 2 ml i røret. Resuspender cellepelleten i en milliliter primært urinmedium som inneholder amfotericin per 50 ml opprinnelig behandlet urin.
Fjern gelatin og tilsett en milliliter av suspensjonen i en brønn med gelatinbelagt 12 brønnplate. Inkuber platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. For å forberede en kjellermembranmatrise belagt 12 brønnplate, tilsett 500 mikroliter kjellermembranmatrise per brønn.
Beveg platen for å fordele væsken og inkuber den ved 37 grader Celsius i en time. Etter inkubering, erstatt kjellermembranmatrisen med 900 mikroliter REMC medium og oppbevar den ved 37 grader Celsius til bruk. Beregn volumet av Sendai-virus som trengs for en rekke infeksjoner på fem ved hjelp av ligningen.
Tine raskt komponentene i Sendai-omprogrammeringssettet i vannbadet temperert ved 37 grader Celsius. Legg REMC medium for totalt 100 mikroliter til et rør før du legger til det beregnede volumet av Sendai virus og blanding. Etter dissosiasjon av urincellene som beskrevet i manuskriptet, telle cellene ved hjelp av celletelleren og overføre ønsket antall celler til et 1,5 milliliter rør.
Oppnå pelleten ved sentrifugering og resuspender den i 100 mikroliter av den tilberedte Sendai-virusblandingen. Inkuber røret i en time ved 37 grader Celsius for suspensjonsinfeksjon. Etter inkubering, tilsett REMC til totalt en milliliter før såing av cellesuspensjonen i kjellermembranmatrisen belagt 12 brønnplate.
Etter transduksjon, bytt medium annenhver dag til utvikling av induserte pluripotente stamceller, eller IPSC, kolonier med bytte til PSC-generasjonsmedium på dag fem. Når IPSC-koloniene vokser seg store nok til klumppassasje, aspirerer du mediet fra de dyrkede cellene og vasker cellene forsiktig med 500 mikroliter DPBS. Etter å ha fjernet DPBS, tilsett 500 mikroliter 0, 5 millimolar EDTA til brønnen og inkuber i to til fem minutter.
Nøye observere cellene under mikroskopet til koloniene begynner å løsne. Når kantene på koloniene begynner å skrelle av og hull mellom cellene blir synlige, fjern EDTA og tilsett forsiktig 500 mikroliter DPBS. Aspirer DPBS og skyll brønnen med 500 mikroliter PSC-kulturmedium ved hjelp av en P-1000-pipette.
Pipett opp og ned for å spre koloniene i klumper av passende størrelse. Avhengig av sammenløpet, ønsket tetthet av de sådde cellene og IPSC klonal preferanse, overfør 1/10 til 1/50 av celleklumpsuspensjonen til de nye brønnene. Beveg platen forsiktig frem og tilbake flere ganger for å fordele klumpene jevnt i brønnen.
Inkuber platen i minst 30 minutter ved 37 grader Celsius for å la klumpene feste seg. Bytt medium hver andre til tredje dag til koloniene vokser seg store nok til å passere. Etter isolasjon kan man se plateepitelceller og ulike mindre runde celler som ble skilt ut med urinen.
De første adherente prolifererende cellene kan sees, og disse cellene vokser til store kolonier som kan passeres. To forskjellige celletyper kan sees, den ene har en epitellignende fenotype og den andre viser en mer mesenkymallignende fenotype med langstrakt form. Etter den første passasjen vokser urincellene som et monolag.
Under IPSCs generering kan man se noen adherente celler, og disse cellene begynner å vise morfologiske endringer, noe som indikerer omprogrammering av cellene. Videre viser cellene som danner kolonier den typiske embryonale stamcellemorfologien. Alle genererte IPSC-er deler den typiske embryonale stamcellelignende kolonimorfologien, karakterisert ved tettpakkede celler med klart definerte kanter.
Immunocytokjemi ble brukt til å teste ekspresjonen av pluripotensassosierte markører i IPSC for gorillaer. Videre viste flowcytometrianalyse at de analyserte-IPSCene er positive for TRA-1-60. Videre er gorilla-IPSC-ene i stand til å differensiere i endoderm-, mesoderm- og ektodermlinjer.
Et økt antall differensierte celler og tap av grenseintegritet og ensartethet indikerer dårlig IPSC-kvalitet. I motsetning til dette betyr definerte grenser, tett cellulær emballasje og fremtredende nukleoler IPSC-er av høy kvalitet. På grunn av koronavariabiliteten må man optimalisere klonespesifikke forhold som delingsforhold, passasjetid og klumpstørrelse for å holde primat-IPSC-er i ferd med å vokse seg sunne.
Som kvalitetskontroll av etablerte IPSC-er kan man verifisere prepotens ved direkte eller indirekte differensieringsinduksjon som in vitro EV-differensiering, i tillegg til å sjekke markørgenuttrykk.