Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة فاسيليكي إيكونوموبولوس على نصها الداخلي لقياس إشارة الاستيفاء في ImageJ. نود أيضا أن نشكر CITIUS (جامعة إشبيلية) وجميع موظفيها على دعمهم خلال المظاهرة. تم دعم هذا العمل من قبل FEDER I + D + i-USE الإسبانية ، US-1264152 من جامعة إشبيلية ، ووزارة العلوم ، Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

تم الحصول على أنواع الفطر الأربعة المختلفة الموصوفة في هذا البروتوكول من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. عزل β الجلوكان الفطرية
<ol><li>استخراج وعزل السكريات الفطر القابلة للذوبان ملاحظة: تم الحصول على السكريات الفطر القابلة للذوبان (SMPs) وفقا للإجراء المو...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

يصف هذا العمل استخدام التقنيات الراسخة لعزل محتوى SβGs وتنقيته وتوصيف محتوى SβGs بنجاح من أربعة فطريات مختلفة. أظهرت النتائج كيف أنه بعد استخراج الماء الساخن من SMPs ، التي تم الحصول عليها من P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus ، تليها المعالجة المائية باستخدام α-amylase و glucosidase و pro...

على الرغم من ظهور إنجازات جديدة في مجال الأورام العصبية ، فإن متوسط العمر المتوقع لمرضى الورم الأرومي الدبقي لا يزال ضئيلا. تعتمد العلاجات القياسية الذهبية ضد أورام المخ على دمج الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك ، في العقد الماضي ، ظهر العلاج المناعي كاستراتيجية قوية لعلاج أنواع مختلفة من السرطان1. وهكذا ، أصبحت إمكانية تسخير الاستجابة المناعية للجسم ضد الخلايا السرطانية مؤخرا الركيزة الرابعة لعلم الأورام.
من المعروف منذ فترة طويلة أن أحد أكبر التحديات في هذا المجال هو التغلب على كبت المناعة القوي الموجود داخل البيئة المكروية للورم2. على وجه الخصوص ، في حالة الورم الأرومي الدبقي ، أحد أكثر أشكال سرطان الدماغ شيوعا وعدوانية ، فإن الكشف عن المسارات الرئيسية التي تنظم مثل هذه السيناريوهات المؤيدة للورم وإيجاد مركبات جديدة يمكن أن تتصدى للاستجابة المحبطة للجهاز المناعي قد يمهد الطريق للعلاجات المستقبلية ضد هذا المرض غير القابل للشفاء.
يمتلك الدماغ خلايا الجهاز المناعي الخاصة به ، ونوع الخلايا الأكثر صلة هو الخلايا الدبقية الصغيرة. وقد ثبت أن هذه الخلايا لديها سلوك معقد إلى حد ما عبر الأمراض المركزية المختلفة3. في حالة أورام الدماغ الأولية (على سبيل المثال ، الورم الأرومي الدبقي) ، يتم تحويل هذه الخلايا نحو نمط ظاهري مضاد للالتهابات يدعم الخلايا السرطانية لاستعمار حمة الدماغ3. عززت العديد من المنشورات الدور الرئيسي لهذه الخلايا أثناء تطور الورم. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو أن الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي والبلاعم المتسللة (GAMs) تمثل ثلث إجمالي كتلة الورم ، مما يشير إلى التأثير الواضح لحالات تنشيطها أثناء تطور ورم المخ 4,5.
في هذا السياق ، تم وصف β-glucans الفطرية بأنها جزيئات قوية تؤدي إلى استجابات مناعية فعالة ، بما في ذلك البلعمة وإنتاج العوامل المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى القضاء على العوامل الضارة6،7،8،9،10. تمت دراسة β-glucans الفطرية بشكل عام باستخدام مقتطفات من أجزاء مختلفة من الفطر. ومع ذلك ، فإن إسناد تأثيرات محددة يتطلب تنقيتها لتجنب الغموض والقدرة على فهم آلية عمل هذه الجزيئات مثل العوامل المناعية8.
في هذا العمل ، يتم تنقية β-glucans القابلة للذوبان من الجسم المثمر لأربعة أنواع مختلفة من الفطر ، والتي تستخدم بانتظام كصالحة للأكل (Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor) وكفطر طبي (Ganoderma lucidum و Hericium erinaceus). على وجه الخصوص ، هذه الفطر الأربعة لها استخدام كبير في صناعة الأغذية والأدوية وتم إنتاجها ضمن اقتصاد دائري صديق للبيئة في مؤسسة تجارية (انظر جدول المواد).
من أجل وضع الأساس للاستخدام المستقبلي للجلوكان β الفطرية في علاجات سرطان الدماغ ، فإن استراتيجيات التنقية المحددة جيدا والدراسات قبل السريرية التي تتعمق في تفاعلها المفترض مع خلايا الجهاز المناعي ضرورية لتقييم دورها المحتمل كوسطاء مضادين للورم. يصف هذا العمل الخطوات العديدة للعزل والتنقية اللازمة لاسترداد β-glucans القابلة للذوبان الموجودة داخل الأجسام المثمرة للفطر المختار. بمجرد تنقيتها بنجاح ، يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز نمطها الظاهري الالتهابي. يتم طلاء خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) بوسط مختلف مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة ، تمت معالجته مسبقا بهذه المستخلصات ، ثم يتم تقييم تأثيره على سلوك الخلايا السرطانية. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات التجريبية من مختبرنا (البيانات غير معروضة) كشفت كيف أن الخلايا الدبقية الصغيرة المؤيدة للالتهابات قد تبطئ هجرة الخلايا السرطانية وخصائص الغزو ليس فقط في خلايا الورم الأرومي الدبقي ولكن أيضا في خطوط الخلايا السرطانية الأخرى. قد يوفر هذا العمل متعدد التخصصات أداة مفيدة للباحثين في علم الأورام لاختبار المركبات الواعدة القادرة على تعزيز الاستجابة المناعية في العديد من أنواع الأورام المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

أحد أكبر التحديات في تطوير علاجات فعالة ضد الورم الأرومي الدبقي هو التغلب على قمع المناعة القوي داخل البيئة المكروية للورم. برز العلاج المناعي كاستراتيجية فعالة لتحويل استجابة الجهاز المناعي ضد الخلايا السرطانية. تعد الضامة المرتبطة بالورم الدبقي والخلايا الدبقية الصغيرة (GAMs) من الدوافع الرئيسية لمثل هذه السيناريوهات المضادة للالتهابات. لذلك ، قد يمثل تعزيز الاستجابة المضادة للسرطان في GAMs علاجا مساعدا مشتركا محتملا لعلاج مرضى الورم الأرومي الدبقي. في هذا السياق ، تعرف جزيئات β-glucan الفطرية منذ فترة طويلة باسم معدلات المناعة القوية. تم وصف قدرتها على تحفيز النشاط المناعي الفطري وتحسين الاستجابة للعلاج. وتعزى هذه السمات المعدلة جزئيا إلى قدرتها على الارتباط بمستقبلات التعرف على الأنماط ، والتي ، من المثير للاهتمام ، يتم التعبير عنها بشكل كبير في GAMs. وبالتالي ، يركز هذا العمل على عزل وتنقية واستخدام β-glucans الفطرية لتعزيز استجابة مبيدات الأورام للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي. تستخدم خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) والخلايا الدبقية الصغيرة (BV-2) لاختبار الخصائص المناعية لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية المستخرجة من الفطر المستخدم بكثافة في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية الحالية: Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor و Hericium erinaceus و Ganoderma lucidum. لاختبار هذه المركبات ، تم إجراء فحوصات التحفيز المشترك لقياس تأثير وسط مكيف بالخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا على الانتشار وتنشيط موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الأرومي الدبقي.

تنقية ناجحة من β الجلوكان يتم تلخيص كتلة MP و SMPs و SβGs التي تم الحصول عليها من الأجسام المثمرة ل P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus بعد عملية الاستخراج والتنقية في الجدول 1. يوضح الجدول 2 التركيب الأساسي (إجمالي الكربوهيدرات ، β-glucans ، والبروتين) من ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

يصف البروتوكول الحالي خطوات التنقية والدراسات اللاحقة لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية كجزيئات مناعية محتملة تعزز الخصائص المضادة للورم للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي.

عزل وتنقية β-جلوكان الفطري كاستراتيجية علاج مناعي للورم الأرومي الدبقي

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

بيتا جلوكان الفطرية هي معدلات مهمة للجهاز المناعي. يعد تعزيز بروتوكولات النقاء والعزل أمرا ضروريا لتأكيد دورهم المحتمل كمساعدين مشاركين لعلاج السرطان. تم تحقيق درجة عالية من أربعة بيتا جلوكان مختلفة باستخدام أجهزة مختلفة توجد عادة في البيولوجيا الجزيئية والمختبرات البروتينية.يركز هذا البروتوكول على اختبار آثار بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلية المناعية المقيمة الأكثر وفرة في الدماغ. يمكن أن يؤدي تعديل النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة في الورم الأرومي الدبقي إلى رؤى مهمة في. ابدأ في استخراج السكريات الفطرية القابلة للذوبان أو SMPs عن طريق شطف الأجسام المثمرة الطازجة من Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor و Hericium erinaceus و Ganoderma lucidum بالماء المقطر خمس مرات.ثم جفف أجسام الثمار المغسولة تماما عند 50 درجة مئوية في فرن تجفيف الهواء التقليدي لمدة 24 ساعة تقريبا قبل طحنها في مطحنة شفرة للحصول على حوالي 200 جرام من المسحوق من كل فطر. بعد ذلك ، قم بتعليق 100 جرام من مساحيق الفطر الأربعة أو MP في 1،000 ملليلتر من الماء المقطر والأوتوكلاف التعليق عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، قم بطرد مركزي التعليق الناتج عند 6،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.ثم جفف الراسب الذي يحتوي على السكريات الفطرية غير القابلة للذوبان أو IMPs عند 50 درجة مئوية في فرن تجفيف الهواء لمدة 24 ساعة. تخلص من الراسب وركز المادة الطافية 10 مرات في مبخر دوار. بعد ذلك ، قم بترسيب التركيز الذي يحتوي على SMPs مع الإيثانول طوال الليل عند أربع درجات سلزية.بعد الطرد المركزي لتعليق الإيثانول عند 6،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة واغسل الحبيبات ثلاث مرات بإيثانول 80٪ قبل إذابتها والماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5 إلى 7 ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وقم بإذابة ألفا جلوكان عن طريق معالجة المعلق بوحدتين وأربع وحدات من ألفا الأميليز والجلوكواميلاز على التوالي. بعد ذلك ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 ودرجة الحرارة على 50 درجة مئوية وقم بإذابة البروتينات عن طريق معالجة المعلق بالقلويز بما يعادل 2.5 وحدة لكل جرام من البروتين.بعد التحلل المائي ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتحلل المائي وتنظيف تركيز المادة الطافية خمس مرات في مبخر دوار. ترسيب تركيز الطافات مرة أخرى بإضافة 80٪ إيثانول. لإزالة جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض ، قم بإذابة الراسب في الماء المقطر وتقطيعه في الماء المقطر لمدة 24 ساعة باستخدام 12،000 أغشية أنابيب السليلوز المقطوعة من دالتون.استرجع الجزء القابل للذوبان في الماء وقم بتجميده وجففه لإنتاج بيتا جلوكان قابل للذوبان أو S beta-Gs. تقييم إجمالي الجلوكان وألفا جلوكان بشكل منفصل. قم بقياس قيم بيتا جلوكان الناتجة كفرق بين إجمالي قيم الجلوكان وألفا جلوكان.للحصول على أطياف الأشعة فوق البنفسجية S beta-G باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية ، قم بإعداد 1.0 ملليغرام لكل ملليلتر من كل S beta-G في الماء المقطر. انقل العينة إلى كفيت كوارتز وامسحها ضوئيا في درجة حرارة الغرفة في منطقة 200 إلى 400 نانومتر. تقدير تجانس S beta-Gs والوزن الجزيئي للبوليمرات عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو SEC باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أو نظام HPLC مزود بكاشف مرئي للأشعة فوق البنفسجية وعمود ترشيح جل Superdex TM 200 10/300 GL.سجل أطياف الأشعة تحت الحمراء للعينة على مطياف الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه أو FTIR في نطاق 4،000 إلى 500 في المائة. قم بتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق طلاء خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 لمدة 72 ساعة بتركيز 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من أربعة بيتا جلوكان مختلفة معزولة من P.ostreatus و P.djamor و G.lucidum و H.erinaceus. بعد 72 ساعة ، اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة وقم بتمرير الحجم المتبقي من خلال مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر.ثم قم بتجميد المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل. لعلاج GL 261 باستخدام الوسط المكيف للخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا ، أضف 250 ميكرولترا من الوسط الدبقي الصغير المعالج بالبيتا جلوكان إلى 80٪ من خلايا GL 261 المتقاربة لمدة 72 ساعة. تخلص من الوسيلة بعد 72 ساعة.لم تظهر أطياف الأشعة فوق البنفسجية لمختلف S beta-Gs قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 260 و 280 نانومتر ، مما يشير إلى أن S beta-Gs تفتقر إلى الأحماض النووية والبروتينات. أظهرت كروماتوجرام HPLC تجانسا جيدا مع ذروة رئيسية حادة ومفردة في 10.9 دقيقة ل P.ostreatus ، و 10.5 دقيقة للوسيدوم ، و 11.3 دقيقة ل P.djamor ، و 8.20 دقيقة ل H.erinaceus ، مما يشير إلى أن الكسر يتوافق مع البوليمرات المتجانسة. قامت أطياف FTIR بقياس الاهتزازات الجزيئية المقابلة لروابط السكاريد التساهمية.وأظهرت أن SS beta-Gs يتكون من الكربوهيدرات المترافقة مع الحد الأدنى من البروتين. كشف تحليل HPTLC و GC-MS لملف تعريف السكاريد الأحادي ل S beta-Gs عن وجود كمية كبيرة من D-glucose ، وكميات أصغر من D-galactose و D-mannose ، وأثر D-xylose و D-rhamnose و D-fucose و L-arabinose. باستخدام برنامج نصي داخلي في برنامج ImageJ ، تم تحديد عدد وحدات البكسل الموجبة لكل قناة فلورسنت.استخدم البرنامج النصي عينات التحكم كعتبة لشدة كل فلوروفور وقدم عدد البكسلات. وأشار إلى التعبير لكل علامة بعد ظروف تجريبية مختلفة. ومن المثير للاهتمام أن GL 261 لم يعاني من اختلافات كبيرة فيما يتعلق بانتشار الورم عند التعرض لمختلف الوسائط المشروطة بالخلايا الدبقية الصغيرة.ومع ذلك ، أظهر P.djamor و H.erinaceus تحريضا قويا لزيادة ستة أضعاف وتسعة أضعاف تقريبا في caspase-3 المشقوق على التوالي. يعد ضمان نقاء عالي الجودة من بيتا جلوكان أمرا ضروريا لهذا البروتوكول. يستخدم هذا البروتوكول معدات متطورة مثل مقياس الطيف الضوئي ، HPLC.أو فيتر. استخدام هذه الأدوات يعزز قوة النتائج التي توصلنا إليها. يمكننا بثقة تحليل آثار بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة والحصول على نتائج أكثر ثقة.نظرا لضيق الوقت والعالم ، قمنا بتقييد بروتوكولنا لدراسة بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة. ومع ذلك ، يمكن بسهولة استخدام خلايا أخرى من الجهاز المناعي مثل البلاعم أو الخلايا التائية بسهولة خلال هذا البروتوكول. لأول مرة ، تجمع هذه البروتوكولات بين مجالين مختلفين من المعرفة.أولا ، استخدام إجراءات التكنولوجيا الحيوية لتنقية منتجات معينة ، وثانيا ، استخدام تقنيات زراعة الخلايا لاختبار خصائصها المناعية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

تكييف قنبلة ذبابة الفاكهة كتدبير للتعلم والذاكرة

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

المكوك مربع المقايسة كأداة التعلم النقابي للتقييم المعرفي في التعلم ودراسات الذاكرة باستخدام حمار وحشي الكبار

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

الثقافات العضوية للقشرة البشرية البالغة كنموذج خارج الجسم الحي لزراعة الخلايا الجذعية البشرية والتحقق من صحتها

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

استخدام دماغ جنين الفرخ كنموذج لدراسة سلوك خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

تسليط الضوء على المؤلف: استخدام دماغ جنين الفرخ كنموذج للتحليلات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي لسلوك خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري  

استخدام دماغ جنين الفرخ كنموذج للتحليلات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي لسلوك خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...