Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Vasiliki Economopoulos for hendes interne script til måling af fuluorescenssignalet i ImageJ. Vi vil også gerne takke CITIUS (universitetet i Sevilla) og alt deres personale for deres støtte under demonstrationen. Dette arbejde blev støttet af den spanske FEDER I + D + i-USE, US-1264152 fra universitetet i Sevilla, og Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

De fire forskellige svampevarianter, der er beskrevet i denne protokol, blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Isolering af svampe β-glucaner
<ol><li>Ekstraktion og isolering af opløselige svampepolysaccharider BEMÆRK: Opløselige svampepolysaccharider (SMP'er) blev opnået i henhold til proceduren skematisk vist i figur 1.<ol><li>Skyl forsigtigt friske frugtlegemer af P. ostreatus, P. dj...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Dette arbejde beskriver brugen af veletablerede teknikker til succesfuldt at isolere, rense og karakterisere indholdet af SβG'er fra fire forskellige svampe. Resultaterne viste, hvordan indholdet af α-glucan og protein blev reduceret efter varmtvandsekstraktion af SMP'er, opnået fra P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus, efterfulgt af hydrolytisk behandling med α-amylase, glucosidase og protease, hvilket signifikant berigede mængden af rene SβG'er.
<p class="jov...

På trods af fremkomsten af nye resultater inden for neuro-onkologi forbliver glioblastompatienters forventede levetid mager. Guldstandardbehandlinger mod hjernetumorer er baseret på sammenlægning af kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. Men i det sidste årti har immunterapi vist sig som en stærk strategi til behandling af forskellige typer kræft1. Således er muligheden for at udnytte kroppens immunrespons mod tumorceller for nylig blevet den fjerde søjle i onkologi.
Det har længe været kendt, at en af de største udfordringer på området er at overvinde den stærke immunsuppression, der findes i tumormikromiljøet2. Især i tilfælde af glioblastom, en af de mest almindelige og aggressive former for hjernekræft, kan opklaring af nøgleveje, der orkestrerer sådanne protumorale scenarier og finde nye forbindelser, der kan modvirke immunsystemets deprimerende respons, bane vejen for fremtidige terapier mod denne uhelbredelige sygdom.
Hjernen har sine egne immunsystemceller, og den mest relevante celletype er microglia. Disse celler har vist sig at have en ret kompleks adfærd på tværs af forskellige centrale sygdomme3. I tilfælde af primære hjernetumorer (fx glioblastom) skiftes disse celler mod en antiinflammatorisk fænotype, der understøtter tumorceller til at kolonisere hjernens parenchyma3. Talrige publikationer har forbedret disse cellers hovedrolle under tumorprogression. En af hovedårsagerne til dette er, at gliomassocierede mikroglia og infiltrerede makrofager (GAM'er) tegner sig for en tredjedel af den samlede tumormasse, hvilket tyder på den utvetydige indflydelse af deres aktiveringstilstande under hjernetumorprogression 4,5.
På denne måde er svampe- β-glucaner blevet beskrevet som potente molekyler, der udløser effektive immunresponser, herunder fagocytose og proinflammatorisk faktorproduktion, hvilket fører til eliminering af skadelige stoffer 6,7,8,9,10. Svampe β-glucaner er generelt blevet undersøgt ved hjælp af ekstrakter fra forskellige svampedele. Tilskrivningen af specifikke virkninger kræver imidlertid dets oprensning for at undgå tvetydigheder og for at kunne forstå virkningsmekanismen for sådanne molekyler som immunmodulerende midler8.
I dette arbejde renses opløselige β-glucaner fra frugtlegemet af fire forskellige svampe, der regelmæssigt anvendes som spiselige (Pleurotus ostreatus og Pleurotus djamor) og som medicinske (Ganoderma lucidum og Hericium erinaceus) svampe. Især disse fire svampe har stor anvendelse i fødevare- og medicinalindustrien og blev produceret inden for en miljøvenlig cirkulær økonomi i en kommerciel virksomhed (se materialetabel).
For at lægge grundlaget for den fremtidige anvendelse af svampe-β-glucaner i hjernekræftterapier er veldefinerede oprensningsstrategier og prækliniske undersøgelser, der dykker ned i deres formodede interaktion med immunsystemets celler, afgørende for at evaluere deres potentielle rolle som antitumormediatorer. Dette arbejde beskriver de mange trin i isolering og rensning, der er nødvendige for at hente de opløselige β-glucaner indeholdt i frugtlegemerne i den udvalgte svamp. Når de er renset, aktiveres mikrogliaceller for at forbedre deres inflammatoriske fænotype. Mus glioblastomceller (GL261) er belagt med et andet mikroglia-konditioneret medium, der tidligere er behandlet med disse ekstrakter, og derefter evalueres dets virkning på tumorcellernes adfærd. Interessant nok har pilotundersøgelser fra vores laboratorium (data ikke vist) afdækket, hvordan proinflammatorisk mikroglia kan bremse tumorcellemigration og invasionsegenskaber ikke kun i glioblastomceller, men også i andre kræftcellelinjer. Dette tværfaglige arbejde kan give et nyttigt værktøj for onkologiske forskere til at teste lovende forbindelser, der er i stand til at øge immunresponset i mange forskellige typer tumorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

En af de største udfordringer ved at udvikle effektive terapier mod glioblastom er at overvinde den stærke immunundertrykkelse i tumormikromiljøet. Immunterapi har vist sig som en effektiv strategi til at vende immunsystemets respons mod tumorceller. Gliom-associerede makrofager og mikroglia (GAM'er) er vigtige drivkræfter for sådanne antiinflammatoriske scenarier. Derfor kan forbedring af anticancerresponset i GAM'er repræsentere en potentiel co-adjuverende behandling til behandling af glioblastompatienter. På den måde har svampe- β-glucanmolekyler længe været kendt som potente immunmodulatorer. Deres evne til at stimulere den medfødte immunaktivitet og forbedre behandlingsresponsen er blevet beskrevet. Disse modulerende træk tilskrives delvis deres evne til at binde til mønstergenkendelsesreceptorer, som interessant nok i høj grad udtrykkes i GAM'er. Dette arbejde er således fokuseret på isolering, oprensning og efterfølgende anvendelse af svampe-β-glucaner for at forbedre mikroglia's tumoricide respons mod glioblastomceller. Musens glioblastom (GL261) og microglia (BV-2) cellelinjer bruges til at teste de immunmodulerende egenskaber af fire forskellige svampe β-glucaner ekstraheret fra svampe, der er stærkt anvendt i den nuværende biofarmaceutiske industri: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum. For at teste disse forbindelser blev co-stimuleringsassays udført for at måle effekten af et præaktiveret mikroglia-konditioneret medium på proliferation og apoptoseaktivering i glioblastomceller.

Vellykket rensning af β-glucaner Massen af MP, SMP'er og SβG'er opnået fra frugtlegemer af P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus efter ekstraktions- og rensningsprocessen er opsummeret i tabel 1. Den grundlæggende sammensætning (samlede kulhydrater, β-glucaner og protein) af MP, SMP'er og SβG'er opnået fra svampene er afbildet i tabel 2. Disse resultater viser, hvordan protokollen tillod hentning af en stor mæ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Denne protokol beskriver oprensningstrinnene og efterfølgende undersøgelser af fire forskellige svampe-β-glucaner som potentielle immunmodulerende molekyler, der forbedrer mikroglia's antitumorale egenskaber mod glioblastomceller.

Isolering og oprensning af svampe β-glucan som immunterapistrategi for glioblastom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Svampe beta-glucaner er vigtige modulatorer af immunsystemet. Forbedring af renheds- og isolationsprotokollerne er afgørende for at hævde deres potentielle rolle som co-adjuvanser til kræftbehandling. En høj grad af fire forskellige beta-glucaner blev opnået ved hjælp af forskellige enheder, der almindeligvis findes i molekylærbiologiske og proteomiske laboratorier.Denne protokol fokuserer på at teste virkningerne af beta-glucaner på microglia, hjernens mest rigelige residente immuncelle. Modulering af mikrogliafænotypen i glioblastom kan give vigtig indsigt i. Begynd ekstraktionen af opløselige svampepolysaccharider eller SMP'er ved at skylle friske frugtlegemer af Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum med destilleret vand fem gange.Tør derefter de vaskede frugtlegemer helt ved 50 grader Celsius i en konventionel lufttørreovn i ca. 24 timer, før de slibes i en knivmølle, hvorved der opnås ca. 200 gram pulver fra hver svamp. Derefter suspenderes 100 gram af alle fire svampepulvere eller MP i 1.000 ml destilleret vand og autoklave suspensionen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur centrifugeres den resulterende suspension ved 6.000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Derefter tørres bundfaldet indeholdende uopløselige svampepolysaccharider eller IMP'er ved 50 grader Celsius i en lufttørreovn i 24 timer. Bundfaldet kasseres, og supernatanten koncentreres 10 gange i en rotationsfordamper. Derefter udfældes koncentratet indeholdende SMP'er med ethanol natten over ved fire grader Celsius.Efter centrifugering af ethanolsuspensionen ved 6.000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius kasseres supernatanten med en pipette og pelleten vaskes tre gange med 80% ethanol, inden den opløses og destilleret vand. pH justeres til 6,5 til 7 og temperaturen til 37 grader Celsius, og alfa-glucanerne opløses ved at behandle suspensionen med henholdsvis to enheder og fire enheder alfa-amylase og glucoamylase. Derefter justeres pH til 8,0 og temperaturen til 50 grader Celsius og opløses proteinerne ved at behandle suspensionen med alkalase svarende til 2,5 enheder pr. Gram protein.Efter hydrolysen centrifugeres hydrolysatet, og supernatantkoncentratet rengøres fem gange i en rotationsfordamper. Supernatantkoncentratet udfældes igen ved tilsætning af 80 % ethanol. For at fjerne molekyler med lav molekylvægt opløses bundfaldet i destilleret vand og dialyseres i det destillerede vand i 24 timer ved anvendelse af 12.000 Dalton cutoff celluloserørmembraner.Den vandopløselige del genvindes og frysetørres for at producere opløselige beta-glucaner eller S beta-G'er. Det samlede antal glucaner og alfa-glucaner vurderes separat. De resulterende beta-glucanværdier måles som forskellen mellem de samlede glucan- og alfa-glucanværdier.For at opnå S beta-G UV-spektre ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer fremstilles 1,0 milligram pr. milliliter af hver S beta-G i destilleret vand. Overfør prøven til en kvarts kuvette og scan ved stuetemperatur i området 200 til 400 nanometer. Anslå homogeniteten af S beta-G'er og molekylvægten af polymerer ved størrelseseksklusionskromatografi eller SEC ved hjælp af et højtydende væskekromatografi- eller HPLC-system udstyret med en UV-synlig detektor og en Superdex TM 200 10/300 GL gelfiltreringskolonne.Optag prøvens infrarøde spektre på et Fourier-transform infrarødt eller FTIR-spektrometer i området 4.000 til 500 pr. Centimeter. Aktivér mikroglia ved at belægge BV2-mikrogliacellerne i 72 timer med 0,2 milligram pr. milliliter koncentration af fire forskellige beta-glucaner isoleret fra P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum og H.erinaceus. Efter 72 timer opsamles supernatanten med en pipette og det resterende volumen ledes gennem et 0,20 mikrometer sprøjtefilter.Derefter fryses supernatanten ved minus 80 grader Celsius i mindst 24 timer. For at behandle GL 261 med det præaktiverede mikrogliakonditionerede medium tilsættes 250 mikroliter beta-glucanbehandlet mikroglialt medium til 80% sammenflydende GL 261-celler i 72 timer. Kassér mediet efter 72 timer.UV-spektre af de forskellige S beta-G'er viste ikke UV-absorptionstoppe ved 260 og 280 nanometer, hvilket indikerer, at S beta-G'er manglede nukleinsyrer og proteiner. HPLC-kromatogrammerne viste god homogenitet med en skarp og enkelt top på 10,9 minutter for P.ostreatus, 10,5 minutter for lucidum, 11,3 minutter for P.djamor og 8,20 minutter for H.erinaceus, hvilket tyder på, at fraktionen er konsistent med homopolymerer. FTIR-spektrene målte de molekylære vibrationer svarende til kovalente polysaccharidbindinger.Det viste, at SS beta-G'er bestod af kulhydrater konjugeret med et minimalt protein. HPTLC og GC-MS, der analyserede monosaccharidprofilen for S beta-G'er, afslørede tilstedeværelsen af en stor mængde D-glucose, mindre mængder D-galactose og D-mannose og et spor af D-xylose, D-rhamnose, D-fucose og L-arabinose. Ved hjælp af et internt script i ImageJ-software blev antallet af positive pixels for hver fluorescerende kanal kvantificeret.Scriptet brugte kontrolprøver som en tærskel for intensiteten af hver fluorofor og gav antallet af pixels. Det angav udtrykket for hver markør efter forskellige eksperimentelle betingelser. Interessant nok led GL 261 ikke signifikante forskelle med hensyn til tumorproliferation ved eksponering for de forskellige mikrogliakonditionerede medier.Imidlertid viste P.djamor og H.erinaceus stærk induktion af henholdsvis ca. seks gange og ni gange stigning i spaltet caspase-3. Sikring af en høj renhed af beta-glucaner er afgørende for denne protokol. Denne protokol bruger avanceret udstyr såsom spektrofotometer, HPLC.eller FITR. Brug af disse værktøjer øger robustheden af vores resultater. Vi kan trygt analysere virkningerne af beta-glucaner på mikroglia og opnå mere sikre resultater.På grund af tids- og verdensbegrænsninger har vi begrænset vores protokol til undersøgelse af beta-glucaner på mikrogliaceller. Imidlertid kan andre celler fra immunsystemet, såsom makrofager eller T-celler, let være under denne protokol. For første gang kombinerer disse protokoller to forskellige videnområder.For det første anvendelse af bioteknologisk procedure til rensning af specifikke produkter og for det andet anvendelse af cellekulturteknikker til afprøvning af deres immunmodulerende egenskaber.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering og Udvidelse af menneskelige glioblastom multiforme tumorceller Brug af Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Oprensning af musehjerne Fartøjer

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrofysiologiske Metode til Recording Intracellulær Voltage Responses af<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer og interneuroner til Light Stimuli<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning som et mål for læring og hukommelse

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering af Motor Axon Navigation og kvantificering af Axon Arborization i mus embryoner ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rensning af den dendritiske Filopodia-rige fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypiske kulturer af voksen human cortex som ex vivo-model for transplantation og validering af humane stamceller

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Brug af kyllingeembryohjerne som en model til at studere human glioblastomcelleadfærd

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Forfatter Spotlight: Brug af kyllingeembryohjernen som model for in vivo- og ex vivo-analyser af human glioblastomcelleadfærd  

Brug af kyllingembryohjernen som model for in vivo- og ex vivo-analyser af humant glioblastomcelleadfærd

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...