Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
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Nous tenons à remercier le Dr Vasiliki Economopoulos pour son script interne permettant de mesurer le signal de fuluorescence dans ImageJ. Nous tenons également à remercier le CITIUS (Université de Séville) et tout leur personnel pour leur soutien lors de la manifestation. Ce travail a été soutenu par le FEDER espagnol I + D + i-USE, US-1264152 de l’Université de Séville, et le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Les quatre variantes différentes de champignons décrites dans ce protocole ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Isolement des β-glucanes fongiques
<ol><li>Extraction et isolement des polysaccharides solubles des champignons NOTE: Les polysaccharides solubles de champignons (SMP) ont été obtenus selon la procédure schématiquement illustrée à la figure 1.<ol><li>R...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Ce travail décrit l’utilisation de techniques bien établies pour isoler, purifier et caractériser avec succès la teneur en SβG de quatre champignons différents. Les résultats ont montré comment, après l’extraction à l’eau chaude des SMP, obtenue à partir de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus, suivie d’un traitement hydrolytique à la α-amylase, à la glucosidase et à la protéase, la teneur en α-glucane et en protéines a été réduite, enrichissant ainsi...

Malgré l’avènement de nouvelles réalisations dans le domaine de la neuro-oncologie, l’espérance de vie des patients atteints de glioblastome reste maigre. Les thérapies de référence contre les tumeurs cérébrales sont basées sur la fusion de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, au cours de la dernière décennie, l’immunothérapie est apparue comme une stratégie puissante pour traiter différents types de cancer1. Ainsi, la possibilité d’exploiter la réponse immunitaire de l’organisme contre les cellules tumorales est récemment devenue le quatrième pilier de l’oncologie.
On sait depuis longtemps que l’un des plus grands défis dans le domaine est de surmonter la forte immunosuppression trouvée dans le microenvironnement tumoral2. En particulier, dans le cas du glioblastome, l’une des formes les plus courantes et les plus agressives de cancer du cerveau, démêler les voies clés qui orchestrent de tels scénarios pro-tumoraux et trouver de nouveaux composés qui pourraient contrecarrer la réponse déprimante du système immunitaire pourrait ouvrir la voie à de futures thérapies contre cette maladie incurable.
Le cerveau possède ses propres cellules du système immunitaire, et le type de cellule le plus pertinent est la microglie. Il a été prouvé que ces cellules ont un comportement assez complexe à travers différentes maladies centrales3. Dans le cas des tumeurs cérébrales primaires (par exemple, le glioblastome), ces cellules sont déplacées vers un phénotype anti-inflammatoire qui soutient les cellules tumorales pour coloniser le parenchyme cérébral3. De nombreuses publications ont renforcé le rôle majeur de ces cellules au cours de la progression tumorale. L’une des principales raisons en est que les microglies associées au gliome et les macrophages infiltrés (GAM) représentent un tiers de la masse tumorale totale, suggérant ainsi l’influence sans équivoque de leurs états d’activation au cours de la progression tumoralecérébrale 4,5.
Dans cette veine, les β-glucanes fongiques ont été décrits comme des molécules puissantes déclenchant des réponses immunitaires efficaces, y compris la phagocytose et la production de facteurs pro-inflammatoires, conduisant à l’élimination des agents pernicieux 6,7,8,9,10. Les β-glucanes fongiques ont généralement été étudiés en utilisant des extraits de différentes parties de champignons. Cependant, l’attribution d’effets spécifiques nécessite sa purification pour éviter les ambiguïtés et pouvoir comprendre le mécanisme d’action de telles molécules comme les agents immunomodulateurs8.
Dans ce travail, les β-glucanes solubles sont purifiés à partir de la fructification de quatre champignons différents, régulièrement utilisés comme champignons comestibles (Pleurotus ostreatus et Pleurotus djamor) et comme champignons médicinaux (Ganoderma lucidum et Hericium erinaceus). En particulier, ces quatre champignons sont très utilisés dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique et ont été produits dans le cadre d’une économie circulaire respectueuse de l’environnement dans une entreprise commerciale (voir le tableau des matériaux).
Afin de jeter les bases de l’utilisation future des β-glucanes fongiques dans les thérapies du cancer du cerveau, des stratégies de purification bien définies et des études précliniques approfondissant leur interaction présumée avec les cellules du système immunitaire sont essentielles pour évaluer leur rôle potentiel en tant que médiateurs antitumoraux. Ce travail décrit les nombreuses étapes d’isolement et de purification nécessaires pour récupérer les β-glucanes solubles contenus dans les fructifications du champignon sélectionné. Une fois purifiées avec succès, les cellules microgliales sont activées pour améliorer leur phénotype inflammatoire. Les cellules de glioblastome de souris (GL261) sont recouvertes d’un milieu différent conditionné par la microglie, préalablement traité avec ces extraits, puis son effet sur le comportement des cellules tumorales est évalué. Fait intéressant, des études pilotes de notre laboratoire (données non montrées) ont révélé comment la microglie pro-inflammatoire peut ralentir la migration des cellules tumorales et les propriétés d’invasion non seulement dans les cellules de glioblastome, mais aussi dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses. Ce travail multidisciplinaire peut fournir un outil utile aux chercheurs en oncologie pour tester des composés prometteurs capables de stimuler la réponse immunitaire dans de nombreux types de tumeurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

L’un des plus grands défis dans le développement de thérapies efficaces contre le glioblastome est de surmonter la forte suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral. L’immunothérapie est apparue comme une stratégie efficace pour retourner la réponse du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux gliomes (GAM) sont les principaux moteurs de tels scénarios anti-inflammatoires. Par conséquent, l’amélioration de la réponse anticancéreuse dans les GAM peut représenter un traitement coadjuvant potentiel pour traiter les patients atteints de glioblastome. Dans cette veine, les molécules fongiques β-glucane sont connues depuis longtemps comme de puissants modulateurs immunitaires. Leur capacité à stimuler l’activité immunitaire innée et à améliorer la réponse au traitement a été décrite. Ces caractéristiques modulatrices sont en partie attribuées à leur capacité à se lier aux récepteurs de reconnaissance de formes, qui, fait intéressant, sont grandement exprimés dans les GAM. Ainsi, ce travail est axé sur l’isolement, la purification et l’utilisation ultérieure de β-glucanes fongiques pour améliorer la réponse tumoricide de la microglie contre les cellules de glioblastome. Les lignées cellulaires de glioblastome de souris (GL261) et de microglie (BV-2) sont utilisées pour tester les propriétés immunomodulatrices de quatre β-glucanes fongiques différents extraits de champignons fortement utilisés dans l’industrie biopharmaceutique actuelle: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum. Pour tester ces composés, des tests de co-stimulation ont été effectués pour mesurer l’effet d’un milieu conditionné par la microglie pré-activé sur la prolifération et l’activation de l’apoptose dans les cellules de glioblastome.

Purification réussie des β-glucanes La masse de MP, SMP et SβG obtenue à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus après le processus d’extraction et de purification est résumée dans le tableau 1. La composition de base (glucides totaux, β-glucanes et protéines) des MP, SMP et SβG obtenus à partir des champignons est représentée dans le tableau 2. Ces résultats montrent comment...

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Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Le présent protocole décrit les étapes de purification et les études ultérieures de quatre β-glucanes fongiques différents en tant que molécules immunomodulatrices potentielles qui améliorent les propriétés antitumorales de la microglie contre les cellules de glioblastome.

Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Les bêta-glucanes fongiques sont d’importants modulateurs du système immunitaire. L’amélioration de la pureté et des protocoles d’isolement est essentielle pour affirmer leur rôle potentiel en tant que coadjuvants pour le traitement du cancer. Un degré élevé de quatre bêta-glucanes différents a été atteint en utilisant divers dispositifs couramment trouvés dans les laboratoires de biologie moléculaire et de protéomique.Ce protocole vise à tester les effets des bêta-glucanes sur la microglie, la cellule immunitaire résidente la plus abondante du cerveau. La modulation du phénotype de la microglie dans le glioblastome peut fournir des informations importantes sur. Commencez l’extraction des polysaccharides solubles des champignons ou SMP en rinçant cinq fois les fructifications fraîches de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum.Ensuite, séchez complètement les fructifications lavées à 50 degrés Celsius dans un four de séchage à l’air conventionnel pendant environ 24 heures avant de les broyer dans un broyeur à lame en obtenant environ 200 grammes de poudre de chaque champignon. Ensuite, suspendez 100 grammes des quatre poudres de champignons ou MP dans 1 000 millilitres d’eau distillée et autoclavez la suspension à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger la suspension obtenue à 6 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Séchez ensuite le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles ou IMP à 50 degrés Celsius dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 heures. Jeter le précipité et concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif. Ensuite, précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Après avoir centrifugé la suspension d’éthanol à 6 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et laver la pastille trois fois avec de l’éthanol à 80 % avant de la dissoudre et de l’eau distillée. Ajustez le pH à 6,5 à 7 et la température à 37 degrés Celsius et solubilisez les alpha-glucanes en traitant la suspension avec deux unités et quatre unités d’alpha-amylase et de glucoamylase respectivement. Ensuite, ajustez le pH à 8,0 et la température à 50 degrés Celsius et solubilisez les protéines en traitant la suspension avec de l’alkalase équivalente à 2,5 unités par gramme de protéines.Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat et nettoyer le concentré surnageant cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau le concentré surnageant en ajoutant 80% d’éthanol. Pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire, solubiliser le précipité dans de l’eau distillée et le dialyser dans l’eau distillée pendant 24 heures à l’aide de 12 000 membranes de tubes de cellulose de coupure Dalton.Récupérez la partie soluble dans l’eau et lyophilisez-la pour produire des bêta-glucanes solubles ou S bêta-G. Évaluez le nombre total de glucanes et d’alpha-glucanes séparément. Mesurez les valeurs de bêta-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et d’alpha-glucane.Pour obtenir les spectres UV S bêta-G à l’aide d’un spectrophotomètre UV visible, préparer 1,0 milligramme par millilitre de chaque S bêta-G dans de l’eau distillée. Transférer l’échantillon dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante dans la région de 200 à 400 nanomètres. Estimer l’homogénéité des S bêta-G et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion de taille ou SEC à l’aide d’un système de chromatographie liquide ou HPLC haute performance équipé d’un détecteur visible UV et d’une colonne de filtration sur gel Superdex TM 200 10/300 GL.Enregistrer les spectres infrarouges de l’échantillon sur un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier ou FTIR dans la plage de 4 000 à 500 centimètres. Activer la microglie en recouvrant les cellules microgliales BV2 pendant 72 heures avec une concentration de 0,2 milligramme par millilitre de quatre bêta-glucanes différents isolés de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus. Après 72 heures, recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 micromètre.Ensuite, congelez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Pour traiter le GL 261 avec le milieu conditionné par la microglie préactivé, ajoutez 250 microlitres de milieu microglial traité au bêta-glucane à 80% de cellules GL 261 confluentes pendant 72 heures. Jeter le support après 72 heures.Les spectres UV des différents S bêta-G n’ont pas montré de pics d’absorption UV à 260 et 280 nanomètres, ce qui indique que les S bêta-G manquaient d’acides nucléiques et de protéines. Les chromatogrammes CLHP ont montré une bonne homogénéité avec un pic principal aigu et unique à 10,9 minutes pour P. ostreatus, 10,5 minutes pour le lucidum, 11,3 minutes pour P. djamor et 8,20 minutes pour H. erinaceus, ce qui suggère que la fraction est compatible avec les homopolymères. Les spectres FTIR ont mesuré les vibrations moléculaires correspondant aux liaisons polysaccharidiques covalentes.Il a montré que les bêta-G SS comprenaient des glucides conjugués à une protéine minimale. HPTLC et GC-MS analysant le profil monosaccharidique de S bêta-G ont révélé la présence d’une grande quantité de D-glucose, de plus petites quantités de D-galactose et de D-mannose, et une trace de D-xylose, D-rhamnose, D-fucose et L-arabinose. À l’aide d’un script interne dans le logiciel ImageJ, le nombre de pixels positifs pour chaque canal fluorescent a été quantifié.Le script utilisait des échantillons de contrôle comme seuil pour l’intensité de chaque fluorophore et fournissait le nombre de pixels. Il indiquait l’expression de chaque marqueur après différentes conditions expérimentales. Fait intéressant, le GL 261 n’a pas subi de différences significatives en ce qui concerne la prolifération tumorale lors de l’exposition aux différents milieux conditionnés par la microglie.Cependant, P. djamor et H. erinaceus ont montré une forte induction d’une augmentation d’environ six et neuf fois plus de caspase-3 clivée-3 respectivement. Assurer une pureté de haute qualité des bêta-glucanes est essentiel pour ce protocole. Ce protocole utilise des équipements avancés tels que spectrophotomètre, HPLC.ou FITR. L’utilisation de ces outils améliore la robustesse de nos résultats. Nous pouvons analyser en toute confiance les effets des bêta-glucanes sur la microglie et obtenir des résultats plus fiables.En raison du temps et des limites mondiales, nous avons limité notre protocole à l’étude des bêta-glucanes sur les cellules microgliales. Cependant, d’autres cellules du système immunitaire telles que les macrophages ou les cellules T peuvent être facilement pendant ce protocole. Pour la première fois, ces protocoles combinent deux domaines de connaissances différents.Premièrement, l’utilisation de procédures biotechnologiques pour purifier des produits spécifiques et, deuxièmement, l’utilisation de techniques de culture cellulaire pour tester leurs propriétés immunomodulatrices.

Research

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Neurosciences

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