Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
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Wir bedanken uns bei Dr. Vasiliki Economopoulos für ihr hauseigenes Skript zur Messung des Fuluoreszenz-Signals in ImageJ. Wir möchten uns auch bei der CITIUS (Universität Sevilla) und ihrem gesamten Personal für die Unterstützung während der Demonstration bedanken. Diese Arbeit wurde vom spanischen FEDER I + D + i-USE, US-1264152 der Universität Sevilla, und dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 unterstützt

Die vier verschiedenen Pilzvarianten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Isolierung von pilzlichen β-Glucanen
<ol><li>Extraktion und Isolierung von löslichen Pilzpolysacchariden HINWEIS: Lösliche Pilzpolysaccharide (SMPs) wurden gemäß dem in Abbildung 1 schematisch dargestellten Verfahren erhalten.<ol><li>Spülen Sie frische Fruchtkörper...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Diese Arbeit beschreibt die Verwendung etablierter Techniken zur erfolgreichen Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des Gehalts an SβGs aus vier verschiedenen Pilzen. Die Ergebnisse zeigten, wie nach der Heißwasserextraktion von SMPs, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus gewonnen wurden, gefolgt von einer hydrolytischen Behandlung mit α-Amylase, Glucosidase und Protease, der Gehalt an α-Glucan und Protein reduziert wurde, wodurch die Menge an reinen S...

Trotz neuer Errungenschaften auf dem Gebiet der Neuroonkologie ist die Lebenserwartung von Glioblastom-Patienten nach wie vor gering. Goldstandard-Therapien gegen Hirntumore basieren auf der Verschmelzung von Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie. In den letzten zehn Jahren hat sich die Immuntherapie jedoch zu einer wirksamen Strategie zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt1. So ist die Möglichkeit, die körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen nutzbar zu machen, in jüngster Zeit zur vierten Säule der Onkologie geworden.
Es ist seit langem bekannt, dass eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet darin besteht, die starke Immunsuppression in der Tumormikroumgebung zu überwinden2. Insbesondere im Fall des Glioblastoms, einer der häufigsten und aggressivsten Formen von Hirntumoren, könnte die Entschlüsselung wichtiger Signalwege, die solche pro-tumoralen Szenarien orchestrieren, und die Suche nach neuen Verbindungen, die der depressiven Reaktion des Immunsystems entgegenwirken könnten, den Weg für zukünftige Therapien gegen diese unheilbare Krankheit ebnen.
Das Gehirn besitzt eigene Zellen des Immunsystems, und der relevanteste Zelltyp sind Mikroglia. Es wurde nachgewiesen, dass diese Zellen ein ziemlich komplexes Verhalten bei verschiedenen zentralen Krankheiten aufweisen3. Bei primären Hirntumoren (z.B. Glioblastom) werden diese Zellen in Richtung eines antiinflammatorischen Phänotyps verschoben, der Tumorzellen bei der Besiedlung des Hirnparenchyms unterstützt3. Zahlreiche Veröffentlichungen belegen die wichtige Rolle dieser Zellen bei der Tumorprogression. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass Gliom-assoziierte Mikroglia und infiltrierte Makrophagen (GAMs) ein Drittel der gesamten Tumormasse ausmachen, was auf den eindeutigen Einfluss ihrer Aktivierungszustände während der Progression von Hirntumoren hindeutet 4,5.
In diesem Sinne wurden pilzliche β-Glucane als starke Moleküle beschrieben, die wirksame Immunreaktionen auslösen, einschließlich Phagozytose und Produktion entzündungsfördernder Faktoren, was zur Eliminierung schädlicher Stoffe führt 6,7,8,9,10. Pilze β-Glucane wurden im Allgemeinen mit Extrakten aus verschiedenen Pilzteilen untersucht. Die Zuordnung spezifischer Wirkungen erfordert jedoch eine Reinigung, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden und den Wirkmechanismus solcher Moleküle als immunmodulatorische Wirkstoffe verstehen zu können8.
In dieser Arbeit werden lösliche β-Glucane aus dem Fruchtkörper von vier verschiedenen Pilzen gereinigt, die regelmäßig als essbare (Pleurotus ostreatus und Pleurotus djamor) und als Heilpilze (Ganoderma lucidum und Hericium erinaceus) verwendet werden. Insbesondere in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie finden diese vier Pilze große Verwendung und wurden im Rahmen einer umweltfreundlichen Kreislaufwirtschaft in einem Gewerbebetrieb hergestellt (siehe Materialtabelle).
Um den Grundstein für den zukünftigen Einsatz von Pilz-β-Glucanen in der Therapie von Hirntumoren zu legen, sind klar definierte Aufreinigungsstrategien und präklinische Studien, die sich mit ihrer mutmaßlichen Interaktion mit Zellen des Immunsystems befassen, unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Anti-Tumor-Mediatoren zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt die zahlreichen Schritte der Isolierung und Reinigung, die erforderlich sind, um die löslichen β-Glucane zu gewinnen, die in den Fruchtkörpern des ausgewählten Pilzes enthalten sind. Nach erfolgreicher Reinigung werden die Mikrogliazellen aktiviert, um ihren entzündlichen Phänotyp zu verstärken. Maus-Glioblastomzellen (GL261) werden mit einem anderen Mikroglia-konditionierten Medium beschichtet, das zuvor mit diesen Extrakten behandelt wurde, und dann wird seine Wirkung auf das Verhalten der Tumorzellen untersucht. Interessanterweise haben Pilotstudien aus unserem Labor (Daten nicht gezeigt) aufgedeckt, wie entzündungsfördernde Mikroglia die Migration von Tumorzellen und die Invasionseigenschaften nicht nur in Glioblastomzellen, sondern auch in anderen Krebszelllinien verlangsamen können. Diese multidisziplinäre Arbeit könnte ein nützliches Werkzeug für Onkologieforscher sein, um vielversprechende Wirkstoffe zu testen, die in der Lage sind, die Immunantwort bei vielen verschiedenen Tumorarten zu verstärken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung wirksamer Therapien gegen das Glioblastom ist die Überwindung der starken Immunsuppression in der Tumormikroumgebung. Die Immuntherapie hat sich als wirksame Strategie herausgestellt, um die Reaktion des Immunsystems gegen Tumorzellen zu richten. Gliom-assoziierte Makrophagen und Mikroglia (GAMs) sind wichtige Treiber solcher entzündungshemmenden Szenarien. Daher könnte die Verstärkung des antikanzerösen Ansprechens bei GAMs eine potenzielle co-adjuvante Therapie zur Behandlung von Glioblastom-Patienten darstellen. In diesem Sinne sind pilzliche β-Glucan-Moleküle seit langem als starke Immunmodulatoren bekannt. Ihre Fähigkeit, die angeborene Immunaktivität zu stimulieren und das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern, wurde beschrieben. Diese modulierenden Eigenschaften werden zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, an Mustererkennungsrezeptoren zu binden, die interessanterweise in GAMs stark exprimiert werden. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Isolierung, Reinigung und anschließende Verwendung von pilzlichen β-Glucanen zur Verbesserung der tumoriziden Reaktion von Mikroglia gegen Glioblastomzellen. Die Maus-Zelllinien Glioblastom (GL261) und Mikroglia (BV-2) werden verwendet, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen zu testen, die aus Pilzen extrahiert werden, die in der aktuellen biopharmazeutischen Industrie stark verwendet werden: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum. Um diese Verbindungen zu testen, wurden Co-Stimulations-Assays durchgeführt, um die Wirkung eines voraktivierten Mikroglia-konditionierten Mediums auf die Proliferation und Apoptose-Aktivierung in Glioblastomzellen zu messen.

Erfolgreiche Aufreinigung von β-Glucanen Die Masse an MP, SMPs und SβGs, die aus den Fruchtkörpern von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus nach dem Extraktions- und Reinigungsprozess gewonnen werden, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die grundlegende Zusammensetzung (Gesamtkohlenhydrate, β-Glucane und Protein) von MP, SMPs und SβGs, die aus den Pilzen gewonnen werden, ist in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebni...

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Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reinigungsschritte und anschließenden Studien von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen als potentielle immunmodulatorische Moleküle, die die antitumoralen Eigenschaften von Mikroglia gegen Glioblastomzellen verbessern.

Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie beim Glioblastom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Beta-Glucane von Pilzen sind wichtige Modulatoren des Immunsystems. Die Verbesserung der Reinheits- und Isolationsprotokolle ist unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Co-Adjuvantien für die Krebstherapie zu behaupten. Ein hoher Gehalt an vier verschiedenen Beta-Glucanen wurde mit verschiedenen Geräten erreicht, die üblicherweise in molekularbiologischen und proteomischen Labors zu finden sind.Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Prüfung der Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia, die am häufigsten vorkommende Immunzelle des Gehirns. Die Modulation des Mikroglia-Phänotyps im Glioblastom kann wichtige Erkenntnisse liefern. Beginnen Sie mit der Extraktion von löslichen Pilzpolysacchariden oder SMPs, indem Sie frische Fruchtkörper von Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.Trocknen Sie dann die gewaschenen Fruchtkörper etwa 24 Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem herkömmlichen Lufttrockner vollständig ab, bevor Sie sie in einer Messermühle mahlen, um von jedem Pilz etwa 200 Gramm Pulver zu erhalten. Als nächstes suspendieren Sie 100 Gramm aller vier Pilzpulver oder MP in 1.000 Milliliter destilliertem Wasser und autoklavieren die Suspension bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die entstandene Suspension bei 6.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Anschließend trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden oder IMPs bei 50 Grad Celsius für 24 Stunden an der Luft. Verwerfen Sie den Niederschlag und konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer. Als nächstes wird das SMP-haltige Konzentrat über Nacht bei vier Grad Celsius mit Ethanol ausgefällt.Nachdem Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 G 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Pellet dreimal mit 80%igem Ethanol, bevor Sie es und destilliertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 bis 7 und die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und lösen Sie die Alpha-Glucane, indem Sie die Suspension mit zwei Einheiten bzw. vier Einheiten Alpha-Amylase bzw. Glucoamylase behandeln. Als nächstes stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 und die Temperatur auf 50 Grad Celsius ein und lösen die Proteine, indem Sie die Suspension mit Alkalase behandeln, die 2,5 Einheiten pro Gramm Protein entspricht.Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat zentrifugiert und das überstehende Konzentrat fünfmal in einem Rotationsverdampfer gereinigt. Das überstehende Konzentrat durch Zugabe von 80%igem Ethanol erneut ausfällen. Um niedermolekulare Moleküle zu entfernen, lösen Sie den Niederschlag in destilliertem Wasser und dialysieren Sie ihn 24 Stunden lang im destillierten Wasser mit 12.000 Dalton-Cutoff-Zelluloseschlauchmembranen.Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche Beta-Glucane oder S beta-Gs herzustellen. Bewerten Sie die Gesamtglucane und Alpha-Glucane separat. Messen Sie die resultierenden Beta-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und Alpha-Glucan-Werten.Um die S beta-G UV-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer zu erhalten, bereiten Sie 1,0 Milligramm pro Milliliter jedes S beta-G in destilliertem Wasser vor. Übertragen Sie die Probe in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur im Bereich von 200 bis 400 Nanometern. Schätzen Sie die Homogenität von S beta-Gs und das Molekulargewicht von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie oder SEC unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- oder HPLC-Systems, das mit einem UV-sichtbaren Detektor und einer Superdex TM 200 10/300 GL Gelfiltrationssäule ausgestattet ist.Zeichnen Sie die Infrarotspektren der Probe mit einem Infrarot- oder FTIR-Spektrometer mit Fourier-Transformation im Bereich von 4.000 bis 500 Prozent auf. Aktivieren Sie die Mikroglia, indem Sie die BV2-Mikrogliazellen 72 Stunden lang mit einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter von vier verschiedenen Beta-Glucanen beschichten, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus isoliert wurden. Nach 72 Stunden wird der Überstand mit einer Pipette aufgefangen und das verbleibende Volumen durch einen 0,20-Mikrometer-Spritzenfilter geleitet.Anschließend frieren Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden ein. Um GL 261 mit dem voraktivierten mikrogliakonditionierten Medium zu behandeln, werden 250 Mikroliter mit Beta-Glucan behandeltes Mikrogliamedium für 72 Stunden zu 80 % konfluierenden GL 261-Zellen hinzugefügt. Entsorgen Sie das Medium nach 72 Stunden.Die UV-Spektren der verschiedenen S-beta-Gs zeigten keine UV-Absorptionsspitzen bei 260 und 280 Nanometern, was darauf hindeutet, dass S-beta-Gs Nukleinsäuren und Proteine fehlten. Die HPLC-Chromatogramme zeigten eine gute Homogenität mit einem scharfen und einzelnen Hauptpeak bei 10,9 Minuten für P. ostreatus, 10,5 Minuten für Lucidum, 11,3 Minuten für P. djamor und 8,20 Minuten für H. erinaceus, was darauf hindeutet, dass die Fraktion mit Homopolymeren übereinstimmt. Die FTIR-Spektren maßen die molekularen Schwingungen, die kovalenten Polysaccharidbindungen entsprechen.Es zeigte sich, dass SS beta-Gs aus Kohlenhydraten bestand, die mit einem minimalen Protein konjugiert waren. HPTLC und GC-MS, die das Monosaccharidprofil von S beta-Gs analysierten, zeigten das Vorhandensein einer großen Menge an D-Glucose, kleineren Mengen an D-Galactose und D-Mannose sowie einer Spur von D-Xylose, D-Rhamnose, D-Fucose und L-Arabinose. Mit Hilfe eines hauseigenen Skripts in der ImageJ-Software wurde die Anzahl der positiven Pixel für jeden Fluoreszenzkanal quantifiziert.Das Skript verwendete Kontrollproben als Schwellenwert für die Intensität jedes Fluorophors und gab die Anzahl der Pixel an. Es gab die Expression für jeden Marker nach verschiedenen experimentellen Bedingungen an. Interessanterweise zeigte GL 261 keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Tumorproliferation unter Exposition bei den verschiedenen Mikroglia-konditionierten Medien.P. djamor und H. erinaceus zeigten jedoch eine starke Induktion eines etwa sechsfachen bzw. neunfachen Anstiegs der gespaltenen Caspase-3. Die Gewährleistung einer hochgradigen Reinheit der Beta-Glucane ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll verwendet fortschrittliche Geräte wie Spektralphotometer und HPLC.oder FITR. Die Verwendung dieser Tools erhöht die Robustheit unserer Ergebnisse. Wir können die Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia sicher analysieren und zuverlässigere Ergebnisse erzielen.Aus zeitlichen und weltweiten Gründen haben wir unser Protokoll auf die Untersuchung von Beta-Glucanen auf Mikrogliazellen beschränkt. Andere Zellen des Immunsystems wie Makrophagen oder T-Zellen können jedoch problemlos während dieses Protokolls sein. Zum ersten Mal kombinieren diese Protokolle zwei unterschiedliche Wissensgebiete.Zum einen der Einsatz biotechnologischer Verfahren zur Reinigung bestimmter Produkte und zum anderen der Einsatz von Zellkulturtechniken zur Prüfung ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay als assoziatives Lernwerkzeug zur kognitiven Beurteilung in Lern- und Gedächtnisstudien mit erwachsenen Zebrafischen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Verwendung des Gehirns eines Kükenembryos als Modell zur Untersuchung des Verhaltens menschlicher Glioblastomzellen

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Autor im Rampenlicht: Verwendung des Gehirns des Kükenembryos als Modell für In-vivo- und Ex-vivo-Analysen des Verhaltens menschlicher Glioblastom-Zellen  

Verwendung des Gehirns von Kükenembryonen als Modell für in vivo und ex vivo Analysen des Verhaltens menschlicher Glioblastomzellen

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...