Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ואסיליקי אקונומופולוס על התסריט הפנימי שלה למדידת אות המילוי ב-ImageJ. ברצוננו גם להודות ל-CITIUS (אוניברסיטת סביליה) ולכל אנשיהם על תמיכתם במהלך ההפגנה. עבודה זו נתמכה על ידי הפדרציה הספרדית I + D + i-USE, US-1264152 מאוניברסיטת סביליה, ואת Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

ארבע גרסאות הפטריות השונות המתוארות בפרוטוקול זה התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. בידוד של β-גלוקנים פטרייתיים
<ol><li>מיצוי ובידוד של פוליסכרידים פטרייתיים מסיסים הערה: פוליסכרידים של פטריות מסיסות (SMPs) התקבלו בהתאם להליך שמוצג באופן סכמטי <strong class=...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

עבודה זו מתארת את השימוש בטכניקות מבוססות היטב כדי לבודד, לטהר ולאפיין בהצלחה את התוכן של SβGs מארבע פטריות שונות. התוצאות הראו כיצד לאחר מיצוי מים חמים של SMPs, שהתקבלו מ- P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו- H. erinaceus, ולאחר מכן טיפול הידרוליטי עם α-עמילאז, גלוקוזידאז ופרוטאז, התוכן של α-גלו...

למרות כניסתם של הישגים חדשים בתחום הנוירו-אונקולוגיה, תוחלת החיים של חולי גליובלסטומה נותרה דלה. טיפולים סטנדרטיים נגד גידולי מוח מבוססים על מיזוג של ניתוחים, הקרנות וכימותרפיה. עם זאת, בעשור האחרון, אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה רבת עוצמה לטיפול בסוגים שונים של סרטן1. כך, האפשרות לרתום את התגובה החיסונית של הגוף נגד תאים סרטניים הפכה לאחרונה לעמוד התווך הרביעי של האונקולוגיה.
זה זמן רב ידוע כי אחד האתגרים הגדולים בתחום הוא להתגבר על הדיכוי החיסוני החזק שנמצא בתוך מיקרו-סביבה של הגידול2. בפרט, במקרה של גליובלסטומה, אחת הצורות הנפוצות והאגרסיביות ביותר של סרטן המוח, חשיפת מסלולים מרכזיים המתזמרים תרחישים פרו-גידוליים כאלה ומציאת תרכובות חדשות שיכולות לנטרל את התגובה המדכאת של מערכת החיסון עשויה לסלול את הדרך לטיפולים עתידיים נגד מחלה חשוכת מרפא זו.
למוח יש תאי מערכת חיסון משלו, וסוג התא הרלוונטי ביותר הוא מיקרוגליה. תאים אלה הוכחו כבעלי התנהגות מורכבת למדי על פני מחלות מרכזיות שונות3. במקרה של גידולי מוח ראשוניים (למשל, גליובלסטומה), תאים אלה מוסטים לכיוון פנוטיפ אנטי דלקתי התומך בתאי הגידול כדי ליישב אתפרנכימה 3 במוח. פרסומים רבים שיפרו את התפקיד העיקרי של תאים אלה במהלך התקדמות הגידול. אחת הסיבות העיקריות לכך היא שתאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה ומקרופאגים מסתננים (GAMs) מהווים שליש ממסת הגידול הכוללת, מה שמרמז על ההשפעה החד משמעית של מצבי ההפעלה שלהם במהלך התקדמות הגידול במוח 4,5.
ברוח זו, β-גלוקנים פטרייתיים תוארו כמולקולות חזקות המפעילות תגובות חיסוניות יעילות, כולל פגוציטוזה וייצור גורמים מעודדי דלקת, המובילים לסילוק חומרים מזיקים 6,7,8,9,10. β-גלוקנים פטרייתיים נחקרו בדרך כלל באמצעות תמציות מחלקי פטריות שונים. עם זאת, ייחוס של השפעות ספציפיות דורש טיהור שלה כדי למנוע עמימות כדי להיות מסוגל להבין את מנגנון הפעולה של מולקולות כגון סוכני immunomodulatory8.
בעבודה זו, β-גלוקנים מסיסים מטוהרים מגוף הפרי של ארבע פטריות שונות, בשימוש קבוע כאכילים (Pleurotus ostreatus ו- Pleurotus djamor) וכפטריות מרפא (Ganoderma lucidum ו - Hericium erinaceus). בפרט, לארבע פטריות אלה יש שימוש רב בתעשיית המזון והתרופות והן יוצרו במסגרת כלכלה מעגלית ידידותית לסביבה במפעל מסחרי (ראו טבלת חומרים).
על מנת להניח את היסודות לשימוש עתידי של β-גלוקנים פטרייתיים בטיפולים בסרטן המוח, אסטרטגיות טיהור מוגדרות היטב ומחקרים פרה-קליניים המתעמקים באינטראקציה המשוערת שלהם עם תאי מערכת החיסון חיוניים להערכת תפקידם הפוטנציאלי כמתווכים נגד גידולים. עבודה זו מתארת את השלבים הרבים של בידוד וטיהור הדרושים כדי להחזיר את β-גלוקנים מסיסים הכלולים בגופי הפרי של הפטרייה שנבחרה. לאחר טיהור מוצלח, תאי מיקרוגליה מופעלים כדי לשפר את הפנוטיפ הדלקתי שלהם. תאי גליובלסטומה של עכבר (GL261) מצופים בתווך מותנה אחר המותנה במיקרוגליה, שטופל בעבר בתמציות אלה, ולאחר מכן מוערכת השפעתו על התנהגות תאי הגידול. באופן מעניין, מחקרי פיילוט מהמעבדה שלנו (נתונים לא מוצגים) חשפו כיצד תאי מיקרוגליה פרו-דלקתיים עשויים להאט את נדידת תאי הגידול ואת תכונות הפלישה לא רק בתאי גליובלסטומה אלא גם בשורות תאים סרטניים אחרים. עבודה רב-תחומית זו עשויה לספק כלי שימושי לחוקרי אונקולוגיה לבחון תרכובות מבטיחות המסוגלות להגביר את התגובה החיסונית בסוגים רבים ושונים של גידולים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

אחד האתגרים הגדולים ביותר בפיתוח טיפולים יעילים נגד גליובלסטומה הוא התגברות על הדיכוי החיסוני החזק בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה יעילה להפוך את תגובת מערכת החיסון נגד תאים סרטניים. מקרופאגים ותאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה (GAMs) הם הגורמים העיקריים לתרחישים אנטי-דלקתיים כאלה. לכן, שיפור התגובה האנטי-סרטנית ב-GAMs עשוי להוות טיפול קו-אדג'ובנטי פוטנציאלי לטיפול בחולי גליובלסטומה. ברוח זו, מולקולות β-גלוקן פטרייתיות ידועות מזה זמן רב כאפנון חיסוני רב עוצמה. תוארה יכולתם לעורר את הפעילות החיסונית המולדת ולשפר את התגובה הטיפולית. תכונות אפנון אלה מיוחסות בחלקן ליכולתן להיקשר לקולטני זיהוי דפוסים, אשר, באופן מעניין, באים לידי ביטוי רב ב- GAMs. לפיכך, עבודה זו מתמקדת בבידוד, טיהור ושימוש עוקב של β-גלוקנים פטרייתיים כדי לשפר את התגובה הגידולית של מיקרוגליה נגד תאי גליובלסטומה. קווי התאים גליובלסטומה של עכבר (GL261) ומיקרוגליה (BV-2) משמשים לבדיקת התכונות האימונומודולטוריות של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים המופקים מפטריות שנמצאות בשימוש נרחב בתעשיית הביו-פרמצבטיקה הנוכחית: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ו-Ganoderma lucidum. כדי לבדוק תרכובות אלה, בוצעו בדיקות גירוי משותף כדי למדוד את ההשפעה של תווך מותנה מיקרוגליה מופעל מראש על התפשטות והפעלת אפופטוזיס בתאי גליובלסטומה.

טיהור מוצלח של β-גלוקנים המסה של MP, SMPs ו-SβGs המתקבלת מגופי פרי של P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus לאחר תהליך המיצוי והטיהור מסוכמת בטבלה 1. ההרכב הבסיסי (סך כל הפחמימות, β-גלוקנים וחלבון) של MP, SMPs ו-SβGs המתקבלים מהפטריות מתואר בטבלה 2. תוצאות אלה מרא?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלבי הטיהור ואת המחקרים הבאים של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים כמולקולות אימונומודולטוריות פוטנציאליות המשפרות את התכונות האנטי-גידוליות של תאי מיקרוגליה כנגד תאי גליובלסטומה.

בידוד וטיהור של β-גלוקן פטרייתי כאסטרטגיה אימונותרפית לגליובלסטומה

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

בטא-גלוקנים פטרייתיים הם מודולטורים חשובים של מערכת החיסון. שיפור פרוטוקולי הטוהר והבידוד חיוני לקביעת תפקידם הפוטנציאלי כשותפים לטיפול בסרטן. רמה גבוהה של ארבעה בטא-גלוקנים שונים הושגה באמצעות התקנים שונים הנפוצים בביולוגיה מולקולרית ובמעבדות פרוטאומיות.פרוטוקול זה מתמקד בבדיקת ההשפעות של בטא-גלוקנים על מיקרוגליה, תא החיסון הנפוץ ביותר במוח. אפנון הפנוטיפ של מיקרוגליה בגליובלסטומה יכול להניב תובנות חשובות לגבי. התחילו את המיצוי של פוליסכרידים פטרייתיים מסיסים או SMPs על ידי שטיפת גופי פרי טריים של Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ו-Ganoderma lucidum במים מזוקקים חמש פעמים.לאחר מכן יבשו את גופי הפרי השטופים לחלוטין ב 50 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש אוויר רגיל במשך כ -24 שעות לפני טחינתם בטחנת להב קבלת כ -200 גרם אבקה מכל פטרייה. לאחר מכן, להשעות 100 גרם של כל ארבע אבקות פטריות או MP ב 1, 000 מיליליטר של מים מזוקקים autoclave את ההשעיה ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את המתלה שנוצר ב 6, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן יבש את המשקע המכיל פוליסכרידים פטריות מסיסים או IMPs ב 50 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש באוויר במשך 24 שעות. השליכו את המשקע ורכזו את הסופרנאטנט 10 פעמים במאייד סיבובי. לאחר מכן, זרזו את התרכיז המכיל SMPs עם אתנול למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה של תרחיף אתנול ב 6, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant עם פיפטה ולשטוף את הגלולה שלוש פעמים עם 80% אתנול לפני המסתו ומים מזוקקים. כוונן את רמת החומציות ל-6.5 עד 7 ואת הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס והמיס את האלפא-גלוקנים על ידי טיפול בתרחיף עם שתי יחידות וארבע יחידות של אלפא-עמילאז וגלוקועמילאז בהתאמה. לאחר מכן, להתאים את ה- pH ל 8.0 ואת הטמפרטורה ל 50 מעלות צלזיוס ולהמיס את החלבונים על ידי טיפול בתרחיף עם אלקלאז שווה ערך ל 2.5 יחידות לגרם חלבון.לאחר הידרוליזה, צנטריפוגו את ההידרוליזה ונקו את תרכיז הסופרנאטנט חמש פעמים במאייד סיבובי. זרזו שוב את תרכיז הסופרנאטנט על ידי הוספת 80% אתנול. כדי להסיר מולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך, להמיס את המשקע במים מזוקקים ולטשטש אותו במים המזוקקים למשך 24 שעות באמצעות 12, 000 ממברנות צינור תאית בחיתוך דלתון.יש לשחזר את החלק המסיס במים ולייבש אותו בהקפאה כדי לייצר בטא-גלוקנים מסיסים או S בטא-Gs. הערך את סך כל הגלוקנים והאלפא-גלוקנים בנפרד. מדוד את ערכי בטא-גלוקן המתקבלים כהפרש בין ערכי הגלוקן הכולל לערכי אלפא-גלוקן.כדי לקבל את ספקטרום UV S beta-G באמצעות ספקטרופוטומטר נראה UV, להכין 1.0 מיליגרם למיליליטר של כל S beta-G במים מזוקקים. מעבירים את הדגימה לקובט קוורץ וסורקים בטמפרטורת החדר באזור של 200 עד 400 ננומטר. הערך את ההומוגניות של S beta-Gs ואת המשקל המולקולרי של פולימרים לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל או SEC באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או מערכת HPLC המצוידת בגלאי UV גלוי ועמודת סינון ג'ל Superdex TM 200 10/300 GL.רשום את ספקטרום האינפרא אדום של הדגימה על ספקטרומטר אינפרא אדום או FTIR של התמרת פורייה בטווח של 4, 000 עד 500 לסנטימטר. הפעל את תאי מיקרוגליה על ידי ציפוי תאי מיקרוגליה BV2 למשך 72 שעות בריכוז של 0.2 מיליגרם למיליליטר של ארבעה בטא-גלוקנים שונים שבודדו מ- P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum ו- H.erinaceus. לאחר 72 שעות, לאסוף את supernatant עם פיפטה ולהעביר את הנפח הנותר דרך מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר.לאחר מכן מקפיאים את הסופרנאטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. כדי לטפל ב-GL 261 עם התווך המותנה המופעל מראש של מיקרוגליה, יש להוסיף 250 מיקרוליטר של תאי מיקרוגליאה המטופלים בבטא-גלוקן ל-80% תאי GL 261 למשך 72 שעות. יש להשליך את המדיום לאחר 72 שעות.ספקטרום UV של בטא-G S שונים לא הראה שיאי ספיגת UV ב 260 ו 280 ננומטר, מה שמצביע על כך S beta-Gs חסר חומצות גרעין וחלבונים. הכרומטוגרמות HPLC הראו הומוגניות טובה עם שיא חד ויחיד עיקרי של 10.9 דקות עבור P.ostreatus, 10.5 דקות עבור lucidum, 11.3 דקות עבור P.djamor, ו- 8.20 דקות עבור H.erinaceus, דבר המצביע על כך שהשבר עקבי עם הומופולימרים. ספקטרום FTIR מדד את התנודות המולקולריות המתאימות לקשרים רב-סוכריים קוולנטיים.המחקר הראה כי SS beta-Gs מורכב מפחמימות מצומדות עם חלבון מינימלי. HPTLC ו-GC-MS שניתחו את הפרופיל החד-סוכרי של S beta-Gs חשפו נוכחות של כמות גדולה של D-גלוקוז, כמויות קטנות יותר של D-גלקטוז ו-D-מנוז, ועקבות של D-xylose, D-rhamnose, D-fucose ו-L-arabinose. באמצעות סקריפט פנימי בתוכנת ImageJ, כומתו מספר הפיקסלים החיוביים עבור כל ערוץ פלואורסצנטי.הסקריפט השתמש בדגימות בקרה כסף לעוצמה של כל פלואורופור וסיפק את מספר הפיקסלים. הוא ציין את הביטוי עבור כל סמן לאחר תנאי ניסוי שונים. מעניין לציין כי GL 261 לא סבל מהבדלים משמעותיים לגבי התפשטות הגידול בחשיפה לאמצעי המיקרוגליה השונים.עם זאת, P.djamor ו- H.erinaceus הראו אינדוקציה חזקה של עלייה של בערך פי שישה ותשעה בקספאז-3 שסוע בהתאמה. הבטחת טוהר ברמה גבוהה של בטא-גלוקנים חיונית לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה משתמש בציוד מתקדם כגון ספקטרופוטומטר, HPLC.או FITR. שימוש בכלים אלה משפר את איתנות הממצאים שלנו. אנו יכולים לנתח בביטחון את ההשפעות של בטא-גלוקנים על תאי מיקרוגליה ולקבל תוצאות בטוחות יותר.בשל מגבלת הזמן והעולם, הגבלנו את הפרוטוקול שלנו לחקר בטא-גלוקנים על תאי מיקרוגליה. עם זאת, תאים אחרים ממערכת החיסון כגון מקרופאגים או תאי T יכולים להיות בקלות במהלך פרוטוקול זה. לראשונה, פרוטוקולים אלה משלבים שני תחומי ידע שונים.ראשית, השימוש בהליך ביוטכנולוגי לטיהור מוצרים ספציפיים, ושנית, שימוש בטכניקות תרבית תאים כדי לבדוק את התכונות האימונומודולטוריות שלהם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

תסיסנית חיזור התניה כמדד למידה וזיכרון

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

מעבורת Box Assay ככלי למידה אסוציאטיבי להערכה קוגניטיבית בלימודי למידה וזיכרון באמצעות דגי זברה למבוגרים

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

שימוש במוח עובר אפרוח כמודל לחקר התנהגות תאי גליובלסטומה אנושיים

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

מחבר זרקור: שימוש במוח עובר אפרוח כמודל לניתוחי In Vivo ו- Ex Vivo של התנהגות תאי גליובלסטומה אנושיים  

שימוש במוח עובר אפרוח כמודל לניתוחי In Vivo ו - Ex Vivo של התנהגות תאי גליובלסטומה אנושיים

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...