Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
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Vorremmo ringraziare la dott.ssa Vasiliki Economopoulos per il suo script interno per misurare il segnale di fuluorescenza in ImageJ. Vorremmo anche ringraziare la CITIUS (Università di Siviglia) e tutto il loro personale per il loro sostegno durante la manifestazione. Questo lavoro è stato sostenuto dallo spagnolo FEDER I + D + i-USE, US-1264152 dell'Università di Siviglia, e dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Le quattro diverse varianti di funghi descritte in questo protocollo sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Isolamento di β-glucani fungini
<ol><li>Estrazione e isolamento di polisaccaridi solubili di funghi NOTA: I polisaccaridi solubili dei funghi (SMP) sono stati ottenuti secondo la procedura schematicamente mostrata nella Figura 1.<ol><li>Risciacquare delicatamente i corpi fruttifer...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Questo lavoro descrive l'uso di tecniche consolidate per isolare, purificare e caratterizzare con successo il contenuto di SβG da quattro diversi funghi. I risultati hanno mostrato come dopo l'estrazione con acqua calda di SMP, ottenuti da P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguita da un trattamento idrolitico con α-amilasi, glucosidasi e proteasi, il contenuto di α-glucano e proteine è stato ridotto, arricchendo così significativamente la quantità di SβG puri.<...

Nonostante l'avvento di nuove conquiste nel campo della neuro-oncologia, l'aspettativa di vita dei pazienti con glioblastoma rimane scarsa. Le terapie gold standard contro i tumori cerebrali si basano sulla fusione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, nell'ultimo decennio, l'immunoterapia è emersa come una potente strategia per trattare diversi tipi di cancro1. Pertanto, la possibilità di sfruttare la risposta immunitaria del corpo contro le cellule tumorali è recentemente diventata il quarto pilastro dell'oncologia.
È noto da tempo che una delle maggiori sfide nel campo è quella di superare la forte immunosoppressione trovata all'interno del microambiente tumorale2. In particolare, nel caso del glioblastoma, una delle forme più comuni e aggressive di cancro al cervello, svelare percorsi chiave che orchestrano tali scenari pro-tumorali e trovare nuovi composti che potrebbero contrastare la risposta deprimente del sistema immunitario potrebbe aprire la strada a future terapie contro questa malattia incurabile.
Il cervello possiede le proprie cellule del sistema immunitario e il tipo di cellula più rilevante sono le microglia. Queste cellule hanno dimostrato di avere un comportamento piuttosto complesso in diverse malattie centrali3. Nel caso di tumori cerebrali primari (ad esempio, glioblastoma), queste cellule sono spostate verso un fenotipo anti-infiammatorio che supporta le cellule tumorali per colonizzare il parenchima cerebrale3. Numerose pubblicazioni hanno migliorato il ruolo principale di queste cellule durante la progressione del tumore. Una delle ragioni principali di ciò è che la microglia associata al glioma e i macrofagi infiltrati (GAM) rappresentano un terzo della massa tumorale totale, suggerendo così l'influenza inequivocabile dei loro stati di attivazione durante la progressione del tumore cerebrale 4,5.
In questo senso, i β-glucani fungini sono stati descritti come potenti molecole che innescano risposte immunitarie efficaci, tra cui la fagocitosi e la produzione di fattori pro-infiammatori, portando all'eliminazione di agenti perniciosi 6,7,8,9,10. I β-glucani fungini sono stati generalmente studiati utilizzando estratti di diverse parti di funghi. Tuttavia, l'attribuzione di effetti specifici richiede la sua purificazione per evitare ambiguità e per essere in grado di comprendere il meccanismo d'azione di tali molecole come agenti immunomodulatori8.
In questo lavoro, i β-glucani solubili sono purificati dal corpo fruttifero di quattro diversi funghi, regolarmente impiegati come funghi commestibili (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinali (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). In particolare, questi quattro funghi hanno un grande uso nell'industria alimentare e farmaceutica e sono stati prodotti nell'ambito di un'economia circolare rispettosa dell'ambiente in un'impresa commerciale (vedi Tabella dei materiali).
Al fine di gettare le basi per l'uso futuro di β-glucani fungini nelle terapie del cancro al cervello, strategie di purificazione ben definite e studi preclinici che approfondiscono la loro presunta interazione con le cellule del sistema immunitario sono essenziali per valutare il loro potenziale ruolo come mediatori antitumorali. Questo lavoro descrive i numerosi passaggi di isolamento e purificazione necessari per recuperare i β-glucani solubili contenuti all'interno dei corpi fruttiferi del fungo selezionato. Una volta purificate con successo, le cellule della microglia vengono attivate per migliorare il loro fenotipo infiammatorio. Le cellule di glioblastoma di topo (GL261) sono rivestite con un diverso mezzo condizionato dalla microglia, precedentemente trattato con questi estratti, e quindi viene valutato il suo effetto sul comportamento delle cellule tumorali. È interessante notare che studi pilota del nostro laboratorio (dati non mostrati) hanno scoperto come la microglia pro-infiammatoria possa rallentare la migrazione delle cellule tumorali e le proprietà di invasione non solo nelle cellule di glioblastoma ma anche in altre linee cellulari tumorali. Questo lavoro multidisciplinare può fornire uno strumento utile per i ricercatori oncologici per testare composti promettenti in grado di aumentare la risposta immunitaria in molti diversi tipi di tumori.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

Una delle maggiori sfide nello sviluppo di terapie efficaci contro il glioblastoma è superare la forte soppressione immunitaria all'interno del microambiente tumorale. L'immunoterapia è emersa come una strategia efficace per trasformare la risposta del sistema immunitario contro le cellule tumorali. I macrofagi e le microglia associati al glioma (GAM) sono i principali motori di tali scenari anti-infiammatori. Pertanto, il miglioramento della risposta antitumorale nelle GAM può rappresentare una potenziale terapia coadiuvante per il trattamento dei pazienti con glioblastoma. In questo senso, le molecole fungine di β-glucano sono state a lungo conosciute come potenti modulatori immunitari. È stata descritta la loro capacità di stimolare l'attività immunitaria innata e migliorare la risposta al trattamento. Queste caratteristiche modulanti sono in parte attribuite alla loro capacità di legarsi ai recettori di riconoscimento dei pattern, che, curiosamente, sono molto espressi nei GAM. Pertanto, questo lavoro è focalizzato sull'isolamento, la purificazione e il successivo uso di β-glucani fungini per migliorare la risposta tumoricida della microglia contro le cellule di glioblastoma. Le linee cellulari di glioblastoma di topo (GL261) e microglia (BV-2) sono utilizzate per testare le proprietà immunomodulatorie di quattro diversi β-glucani fungini estratti da funghi pesantemente utilizzati nell'attuale industria biofarmaceutica: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Per testare questi composti, sono stati eseguiti saggi di co-stimolazione per misurare l'effetto di un mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia sulla proliferazione e l'attivazione dell'apoptosi nelle cellule di glioblastoma.

Purificazione riuscita dei β-glucani La massa di MP, SMP e SβG ottenuta dai corpi fruttiferi di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus dopo il processo di estrazione e purificazione è riassunta nella tabella 1. La composizione di base (carboidrati totali, β-glucani e proteine) di MP, SMP e SβG ottenuti dai funghi è raffigurata nella Tabella 2. Questi risultati mostrano come il protocollo abbia permesso il recupero ...

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Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Il presente protocollo descrive le fasi di purificazione e i successivi studi di quattro diversi β-glucani fungini come potenziali molecole immunomodulatrici che potenziano le proprietà antitumorali della microglia contro le cellule di glioblastoma.

Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

I beta-glucani fungini sono importanti modulatori del sistema immunitario. Migliorare i protocolli di purezza e isolamento è essenziale per affermare il loro potenziale ruolo come coadiuvanti per la terapia del cancro. Un alto grado di quattro diversi beta-glucani è stato raggiunto utilizzando vari dispositivi comunemente presenti nei laboratori di biologia molecolare e proteomica.Questo protocollo si concentra sul test degli effetti dei beta-glucani sulla microglia, la cellula immunitaria residente più abbondante del cervello. La modulazione del fenotipo della microglia nel glioblastoma può fornire importanti informazioni su. Iniziare l'estrazione di polisaccaridi solubili di funghi o SMP risciacquando corpi fruttiferi freschi di Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum con acqua distillata cinque volte.Quindi asciugare completamente i corpi fruttiferi lavati a 50 gradi Celsius in un forno di essiccazione ad aria convenzionale per circa 24 ore prima di macinarli in un mulino a lama ottenendo circa 200 grammi di polvere da ciascun fungo. Quindi, sospendere 100 grammi di tutte e quattro le polveri di funghi o MP in 1.000 millilitri di acqua distillata e autoclavare la sospensione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione risultante a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi asciugare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili o IMP a 50 gradi Celsius in un forno ad aria di essiccazione per 24 ore. Scartare il precipitato e concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante. Quindi, precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo durante la notte a quattro gradi Celsius.Dopo aver centrifugato la sospensione di etanolo a 6.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante con una pipetta e lavare il pellet tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo e acqua distillata. Regolare il pH a 6,5-7 e la temperatura a 37 gradi Celsius e solubilizzare gli alfa-glucani trattando la sospensione con due unità e quattro unità di alfa-amilasi e glucoamilasi rispettivamente. Quindi, regolare il pH a 8,0 e la temperatura a 50 gradi Celsius e solubilizzare le proteine trattando la sospensione con alcalasi equivalente a 2,5 unità per grammo di proteine.Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato e pulire il concentrato di surnatante cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente il concentrato di surnatante aggiungendo l'80% di etanolo. Per rimuovere le molecole a basso peso molecolare, solubilizzare il precipitato in acqua distillata e dializzarlo nell'acqua distillata per 24 ore utilizzando 12.000 membrane di tubi di cellulosa Dalton.Recuperare la parte solubile in acqua e liofilizzarla per produrre beta-glucani solubili o S beta-G. Valutare separatamente i glucani totali e gli alfa-glucani. Misurare i valori di beta-glucano risultanti come differenza tra i valori totali di glucano e alfa-glucano.Per ottenere gli spettri UV S beta-G utilizzando uno spettrofotometro UV visibile, preparare 1,0 milligrammi per millilitro di ogni S beta-G in acqua distillata. Trasferire il campione in una cuvetta di quarzo e scansionarlo a temperatura ambiente nella regione da 200 a 400 nanometri. Stimare l'omogeneità di S beta-G e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC utilizzando una cromatografia liquida ad alte prestazioni o un sistema HPLC dotato di un rivelatore UV visibile e di una colonna di filtrazione in gel Superdex TM 200 10/300 GL.Registrare gli spettri infrarossi del campione su uno spettrometro a infrarossi o FTIR a trasformata di Fourier nell'intervallo da 4.000 a 500 per centimetro. Attivare la microglia rivestendo le cellule della microglia BV2 per 72 ore con una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro di quattro diversi beta-glucani isolati da P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum e H.erinaceus. Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante con una pipetta e passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 micrometri.Quindi congelare il surnatante a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Per trattare GL 261 con il mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia, aggiungere 250 microlitri di terreno microgliale trattato con beta-glucano all'80% di cellule GL 261 confluenti per 72 ore. Scartare il mezzo dopo 72 ore.Gli spettri UV dei diversi S beta-G non hanno mostrato picchi di assorbimento UV a 260 e 280 nanometri, indicando che gli S beta-G mancavano di acidi nucleici e proteine. I cromatogrammi HPLC hanno mostrato una buona omogeneità con un picco principale acuto e singolo a 10,9 minuti per P.ostreatus, 10,5 minuti per lucidum, 11,3 minuti per P.djamor e 8,20 minuti per H.erinaceus, suggerendo che la frazione è coerente con gli omopolimeri. Gli spettri FTIR hanno misurato le vibrazioni molecolari corrispondenti ai legami polisaccaridici covalenti.Ha dimostrato che i beta-G SS comprendevano carboidrati coniugati con una proteina minima. HPTLC e GC-MS analizzando il profilo monosaccaridico di S beta-G hanno rivelato la presenza di una grande quantità di D-glucosio, piccole quantità di D-galattosio e D-mannosio e una traccia di D-xilosio, D-ramnosio, D-fucosio e L-arabinosio. Utilizzando uno script interno nel software ImageJ, è stato quantificato il numero di pixel positivi per ciascun canale fluorescente.Lo script utilizzava campioni di controllo come soglia per l'intensità di ciascun fluoroforo e forniva il numero di pixel. Ha indicato l'espressione per ciascun marcatore dopo diverse condizioni sperimentali. È interessante notare che GL 261 non ha subito differenze significative per quanto riguarda la proliferazione tumorale sull'esposizione ai diversi mezzi condizionati dalla microglia.Tuttavia, P.djamor e H.erinaceus hanno mostrato una forte induzione di un aumento di circa sei e nove volte rispettivamente della caspasi-3 scissa. Garantire una purezza di alta qualità dei beta-glucani è essenziale per questo protocollo. Questo protocollo utilizza apparecchiature avanzate come spettrofotometro, HPLC.o FITR. L'utilizzo di questi strumenti migliora la robustezza dei nostri risultati. Possiamo analizzare con sicurezza gli effetti dei beta-glucani sulla microglia e ottenere risultati più sicuri.A causa del tempo e dei limiti mondiali, abbiamo limitato il nostro protocollo allo studio dei beta-glucani sulle cellule microgliali. Tuttavia, altre cellule del sistema immunitario come macrofagi o cellule T possono essere facilmente durante questo protocollo. Per la prima volta, questi protocolli combinano due diverse aree di conoscenza.In primo luogo, l'uso di procedure biotecnologiche per purificare prodotti specifici e, in secondo luogo, l'uso di tecniche di coltura cellulare per testare le loro proprietà immunomodulatorie.

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