Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
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ImageJでフルオレッセンスシグナルを測定するための社内スクリプトを提供してくれたVasiliki Economopoulos博士に感謝します。また、CITIUS(セビリア大学)とそのすべての職員のデモ中のサポートにも感謝します。この研究は、セビリア大学のスペインのFEDER I + D + i-USE、US-1264152、およびシエンシア大学省PID2021-126090OA-I00によってサポートされました

このプロトコルに記載されている4つの異なるキノコの変種は、商業的な情報源から入手しました( 材料表を参照)。
1.真菌β-グルカンの単離
<ol><li>可溶性キノコ多糖類の抽出と単離 注:可溶性キノコ多糖類(SMP)は、 図1に模式的に示される手順に従って得られた。<ol><li>新鮮なオズトリタス菌、オズミガ原虫、エ?...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

この研究では、4つの異なる真菌からSβGの含有量を首尾よく分離、精製、および特性評価するための確立された技術の使用について説明しています。その結果、 P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、 H. erinaceusから得られたSMPを熱水抽出した後、α-アミラーゼ、グルコシダーゼ、プロテアーゼで加水分解処理した後、α-グルカンとタンパク質の含有量が減少し、純粋なSβG?...

神経腫瘍学の分野における新しい成果の出現にもかかわらず、膠芽腫患者の平均余命は依然としてわずかである。脳腫瘍に対するゴールドスタンダードの治療法は、手術、放射線療法、化学療法の融合に基づいています。しかし、過去10年間で、免疫療法はさまざまな種類の癌を治療するための強力な戦略として浮上しています1。このように、腫瘍細胞に対する体の免疫応答を利用する可能性は、最近、腫瘍学の第4の柱となっています。
この分野での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内に見られる強力な免疫抑制を克服することであることは長い間知られていました2。特に、脳腫瘍の最も一般的で攻撃的な形態の1つである膠芽腫の場合、そのような腫瘍促進シナリオを調整する重要な経路を解明し、免疫系の抑うつ反応を打ち消す可能性のある新しい化合物を見つけることは、この不治の病に対する将来の治療法への道を開く可能性があります。
脳はそれ自身の免疫系細胞を持っており、最も関連性の高い細胞型はミクログリアです。これらの細胞は、異なる中枢性疾患にわたってかなり複雑な挙動を有することが証明されている3。原発性脳腫瘍(例えば、膠芽腫)の場合、これらの細胞は、腫瘍細胞が脳実質にコロニーを形成することを支持する抗炎症性表現型に向かってシフトする3。多数の出版物が、腫瘍の進行におけるこれらの細胞の主要な役割を強化している。この主な理由の1つは、神経膠腫関連ミクログリアと浸潤マクロファージ(GAM)が全腫瘍量の3分の1を占めているため、脳腫瘍の進行中の活性化状態の明確な影響を示唆しています4,5。
その静脈において、真菌βグルカンは、食作用および炎症誘発因子産生を含む効果的な免疫応答を引き起こし、有害な物質の排除につながる強力な分子として説明されています6,7,8,9,10。真菌βグルカンは、一般に、さまざまなキノコの部分からの抽出物を使用して研究されてきました。しかしながら、特定の効果の帰属は、あいまいさを避け、免疫調節剤8のような分子の作用機序を理解できるようにするために、その精製を必要とする。
この研究では、可溶性βグルカンは、食用(ヒラタケ および ヒラタケ)および薬用キノコ(霊芝 および ヘリシウムエリナセウス)として定期的に使用される4つの異なるキノコの子実体から精製されます。特に、これらの4つのキノコは、食品および製薬業界で非常に用途があり、営利企業の環境に優しい循環経済内で生産されました( 材料表を参照)。
脳腫瘍治療における真菌βグルカンの将来の使用の基礎を築くためには、明確に定義された精製戦略と免疫系細胞との推定相互作用を掘り下げた前臨床試験が、抗腫瘍メディエーターとしての潜在的な役割を評価するために不可欠です。この研究では、選択したキノコの子実体に含まれる可溶性βグルカンを回収するために必要な分離と精製の多数のステップについて説明しています。精製に成功すると、ミクログリア細胞が活性化され、炎症性表現型が増強されます。マウス神経膠芽腫細胞(GL261)を、これらの抽出物で処理した別のミクログリア馴化培地でコーティングし、腫瘍細胞の挙動に対するその効果を評価します。興味深いことに、私たちの研究室からのパイロット研究(データは示されていません)は、炎症誘発性ミクログリアが膠芽腫細胞だけでなく他の癌細胞株においても腫瘍細胞の移動と浸潤特性をどのように遅らせるかを明らかにしました。この学際的な研究は、腫瘍学研究者が多くの異なる種類の腫瘍における免疫応答を高めることができる有望な化合物をテストするための有用なツールを提供する可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

膠芽腫に対する効果的な治療法を開発する上での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内の強力な免疫抑制を克服することです。免疫療法は、腫瘍細胞に対する免疫系の反応を変えるための効果的な戦略として浮上しています。神経膠腫関連マクロファージおよびミクログリア(GAM)は、このような抗炎症シナリオの主要な推進力である。したがって、GAMにおける抗癌反応を増強することは、膠芽腫患者を治療するための潜在的な補助療法を表す可能性がある。その静脈では、真菌βグルカン分子は強力な免疫調節剤として長い間知られています。自然免疫活性を刺激し、治療反応を改善するそれらの能力が記載されている。これらの調節機能は、興味深いことにGAMで大きく発現しているパターン認識受容体に結合する能力に部分的に起因しています。したがって、この研究は、膠芽腫細胞に対するミクログリアの殺腫瘍応答を増強するための真菌β-グルカンの単離、精製、およびその後の使用に焦点を当てています。マウス神経膠芽腫(GL261)およびミクログリア(BV-2)細胞株は、現在のバイオ医薬品業界で頻繁に使用されているキノコから抽出された4つの異なる真菌βグルカン(ヒラタケ、 ヒラタケジャ モール、 ヘリシウムエリナセウス、および 霊芝)の免疫調節特性をテストするために使用されます。これらの化合物を試験するために、共刺激アッセイを実施して、膠芽腫細胞の増殖およびアポトーシス活性化に対する予め活性化されたミクログリア馴化培地の効果を測定した。

β-グルカンの精製に成功 P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、および H. erinaceus の子実体から抽出および精製プロセス後に得られた MP、SMP、および SβG の質量を 表 1 にまとめた。真菌から得られたMP、SMP、およびSβGの基本組成(総炭水化物、βグルカン、およびタンパク質)を 表2に示します。これらの結果は、プロトコルがSMP中の大...

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Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

本プロトコールは、膠芽腫細胞に対するミクログリアの抗腫瘍特性を増強する可能性のある免疫調節分子としての4つの異なる真菌β−グルカンの精製ステップおよびその後の研究を記載する。

膠芽腫の免疫療法戦略としての真菌β-グルカンの単離精製

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

真菌ベータグルカンは免疫系の重要なモジュレーターです。純度と分離プロトコルを強化することは、がん治療の補助アジュバントとしての潜在的な役割を主張するために不可欠です。分子生物学やプロテオミクス研究室で一般的に見られるさまざまなデバイスを使用して、4つの異なるベータグルカンの高度な結果が得られました。このプロトコルは、脳の最も豊富な常在免疫細胞であるミクログリアに対するベータグルカンの効果をテストすることに焦点を当てています。膠芽腫におけるミクログリア表現型を調節することは、重要な洞察をもたらすことができる。可溶性キノコ多糖類またはSMPの抽出を開始するには、ヒラタケ、ヒラタケ、エリナセウス、霊芝の新鮮な子実体を蒸留水で5回すすぎます。次に、洗浄した子実体を従来の風乾オーブンで摂氏50度で約24時間完全に乾燥させてから、ブレードミルで粉砕し、各キノコから約200グラムの粉末を得ます。次に、100グラムの4つのキノコ粉末すべてまたはMPを1, 000ミリリットルの蒸留水に懸濁し、懸濁液を121°Cで15分間オートクレーブします。室温で30分間インキュベートした後、得られた懸濁液を6, 000Gで4°Cで10分間遠心分離する。次に、不溶性キノコ多糖類またはIMPを含む沈殿物を、風乾オーブンで摂氏50度で24時間乾燥させます。沈殿物を捨て、ロータリーエバポレーターで上清を10倍濃縮します。次に、SMPを含む濃縮物をエタノールで摂氏4度で一晩沈殿させます。エタノール懸濁液を6, 000 Gで4°Cで15分間遠心分離した後、上清をピペットで捨て、ペレットを80%エタノールで3回洗浄してから蒸留水を溶解する。pHを6.5〜7に、温度を摂氏37度に調整し、懸濁液をそれぞれ2ユニットおよび4ユニットのα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼで処理することにより、α-グルカンを可溶化します。次に、pHを8.0に、温度を摂氏50度に調整し、懸濁液をタンパク質1グラムあたり2.5単位に相当するアルカラーゼで処理することにより、タンパク質を可溶化します。加水分解後、加水分解液を遠心分離し、上清濃縮液をロータリーエバポレーターで5回洗浄します。80%エタノールを加えて上清濃縮液を再び沈殿させる。低分子量分子を除去するには、沈殿物を蒸留水に可溶化し、12, 000ダルトンカットオフセルロースチューブ膜を使用して蒸留水中で24時間透析します。水溶性部分を回収し、凍結乾燥して可溶性β-グルカンまたはSβ-Gを生成します。総グルカンとアルファグルカンを別々に評価します。得られたβ-グルカン値を、総グルカン値とα-グルカン値の差として測定します。UV可視分光光度計を使用してSβ-G UVスペクトルを取得するには、蒸留水中で各Sβ-Gの1ミリリットルあたり1.0ミリグラムを調製します。サンプルを石英キュベットに移し、室温で200〜400ナノメートルの領域でスキャンします。UV 可視検出器と Superdex TM 200 10/300 GL ゲルろ過カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーまたは HPLC システムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーまたは SEC によって、S、β-G、およびポリマーの分子量の均一性を推定します。フーリエ変換赤外線またはFTIR分光計でサンプルの赤外線スペクトルを4, 000〜500センチメートルの範囲で記録します。BV2ミクログリア細胞を、P.ostreatus、P.djamor、G.lucidum、およびH.erinaceusから単離された4つの異なるベータグルカンの0.2ミリグラム/ミリリットルの濃度で72時間コーティングすることにより、ミクログリアを活性化します。72時間後、ピペットで上清を収集し、残りの容量を0.20マイクロメートルのシリンジフィルターに通します。次に、上清をマイナス80°Cで少なくとも24時間凍結します。GL 261を事前に活性化したミクログリア馴化培地で処理するには、250マイクロリットルのβ-グルカン処理ミクログリア培地を80%コンフルエントなGL 261細胞に72時間加えます。72時間後に培地を廃棄する。異なるSβ-GのUVスペクトルは、260および280ナノメートルにUV吸収ピークを示さず、Sβ-Gが核酸およびタンパク質を欠いていることを示している。HPLCクロマトグラムは、P.ostreatusで10.9分、ルシダムで10.5分、P.djamorで11.3分、H.erinaceusで8.20分と、主要なシャープで単一のピークと良好な均質性を示し、フラクションがホモポリマーと一致していることが示唆されました。FTIRスペクトルは、共有多糖結合に対応する分子振動を測定した。SSβ-Gは、最小限のタンパク質と結合した炭水化物で構成されていることが示されました。HPTLCおよびGC-MSでSβ-Gの単糖プロファイルを解析したところ、大量のD-グルコース、少量のD-ガラクトースとD-マンノース、および微量のD-キシロース、D-ラムノース、D-フコース、およびL-アラビノースの存在が明らかになりました。ImageJソフトウェアの社内スクリプトを使用して、各蛍光チャンネルの正のピクセル数を定量化しました。このスクリプトは、各蛍光色素の強度の閾値としてコントロールサンプルを使用し、ピクセル数を提供しました。異なる実験条件後の各マーカーの発現を示した。興味深いことに、GL 261は、異なるミクログリア馴化培地への曝露による腫瘍増殖に関して有意差を被らなかった。しかし、P.djamor と H.erinaceus は、切断されたカスパーゼ-3がそれぞれ約 6 倍と 9 倍に増加するという強い誘導を示しました。このプロトコルでは、ベータグルカンの高純度を確保することが不可欠です。このプロトコルは、分光光度計、HPLCなどの高度な機器を使用します。または FITR を使用します。これらのツールを使用すると、調査結果の堅牢性が高まります。ミクログリアに対するベータグルカンの効果を自信を持って分析し、より信頼性の高い結果を得ることができます。時間と世界の制限のために、私たちはプロトコルをミクログリア細胞上のベータグルカンの研究に限定しました。しかしながら、マクロファージまたはT細胞のような免疫系からの他の細胞は、このプロトコールの間に容易に容易にされ得る。初めて、これらのプロトコルは2つの異なる知識分野を組み合わせたものです。第一に、特定の製品を精製するためのバイオテクノロジー手順の使用、および第二に、それらの免疫調節特性をテストするための細胞培養技術の使用。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

神経科学

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

樹状フィロポディアリッチ画の精製

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

成人ゼブラフィッシュを用いた学習・記憶研究における認知評価のための連想学習ツールとしてのシャトルボックスアッセイ

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

ヒト幹細胞移植および検証のための ex vivo モデルとしての成体ヒト皮質の有機型培養

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

ヒト膠芽腫細胞の挙動を研究するためのモデルとしてニワトリ胚脳を使用

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

著者スポットライト:ヒト膠芽腫細胞の挙動のIn vivoおよびex vivo解析のためのモデルとしてのニワトリ胚脳の使用  

ニワトリ胚脳をモデルとしてヒト膠芽腫細胞挙動の in vivoおよび ex vivo 解析(英語)

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...