Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

ImageJ에서 fuluorescence 신호를 측정하기 위한 사내 스크립트를 제공한 Vasiliki Economopoulos 박사에게 감사드립니다. 또한 시위 기간 동안 지원해 주신 CITIUS(세비야 대학교)와 모든 직원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 스페인 FEDER I + D + i-USE의 지원을 받았으며 세비야 대학의 US-1264152 및 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜에 설명된 4가지 다른 버섯 변종은 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).
1. 곰팡이 β글루칸의 분리
<ol><li>용해성 버섯 다당류의 추출 및 분리 참고: 가용성 버섯 다당류(SMP)는 그림 1에 개략적으로 표시된 절차에 따라 얻었습니다.<ol><li>신선한 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. luci...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

이 연구는 4가지 다른 균류에서 SβG의 함량을 성공적으로 분리, 정제 및 특성화하기 위해 잘 확립된 기술의 사용을 설명합니다. 그 결과, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, H. erinaceus로부터 얻은 SMP를 열수 추출한 후 α-아밀라아제, 글루코시다아제, 프로테아제로 가수분해 처리한 후 α-글루칸과 단백질의 함량이 감소하여 순수한 SβG의 양이 크게 풍부해졌습니다.
<p class="jove_...

신경 종양학 분야에서 새로운 업적이 출현 했음에도 불구하고 교 모세포종 환자의 기대 수명은 여전히 미미합니다. 뇌종양에 대한 표준 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 융합을 기반으로 합니다. 그러나 지난 10년 동안 면역요법은 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 강력한 전략으로 부상했다1. 따라서 종양 세포에 대한 신체의 면역 반응을 활용할 수 있는 가능성은 최근 종양학의 네 번째 기둥이 되었습니다.
이 분야에서 가장 큰 과제 중 하나는 종양미세환경2에서 발견되는 강력한 면역억제를 극복하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 특히, 가장 흔하고 공격적인 형태의 뇌암 중 하나인 교모세포종의 경우, 이러한 종양 전(前)종양 시나리오를 조율하는 주요 경로를 밝히고 면역 체계의 우울한 반응을 상쇄할 수 있는 새로운 화합물을 찾는 것은 이 난치병에 대한 미래 치료법의 길을 열 수 있습니다.
뇌는 자체 면역 체계 세포를 가지고 있으며 가장 관련성이 높은 세포 유형은 미세 아교 세포입니다. 이 세포들은 서로 다른 중추 질환에 걸쳐 다소 복잡한 행동을 하는 것으로 입증되었다3. 원발성 뇌종양(예: 교모세포종)의 경우, 이들 세포는 종양 세포가 뇌 실질에 서식하도록 지원하는 항염증 표현형으로 이동한다3. 수많은 출판물이 종양 진행 동안 이러한 세포의 주요 역할을 향상시켰습니다. 그 주된 이유 중 하나는 신경교종 관련 미세아교세포와 침윤성 대식세포(GAM)가 전체 종양 질량의 1/3을 차지하기 때문에 뇌종양 진행 중 활성화 상태의 명백한 영향을 시사하기 때문입니다 4,5.
이러한 맥락에서 진균 β-글루칸은 식균 작용 및 전염증 인자 생성을 포함한 효과적인 면역 반응을 유발하는 강력한 분자로 설명되어 악성 물질인 6,7,8,9,10을 제거합니다. 곰팡이 β글루칸은 일반적으로 다른 버섯 부분의 추출물을 사용하여 연구되었습니다. 그러나, 특정 효과의 귀속은 모호성을 피하고 면역조절제8와 같은 분자의 작용 기전을 이해할 수 있도록 정제를 필요로 한다.
이 연구에서 용해성 β 글루칸은 식용 버섯 (Pleurotus ostreatus 및 Pleurotus djamor) 및 약용 버섯 (Ganoderma lucidum 및 Hericium erinaceus)으로 정기적으로 사용되는 4 가지 버섯의 자실체에서 정제됩니다. 특히, 이 4가지 버섯은 식품 및 제약 산업에서 많이 사용되며 상업 기업의 환경 친화적인 순환 경제 내에서 생산되었습니다( 재료 표 참조).
뇌암 치료에서 진균 β글루칸의 향후 사용을 위한 토대를 마련하기 위해서는 항종양 매개체로서의 잠재적 역할을 평가하기 위해 잘 정의된 정제 전략과 면역계 세포와의 추정 상호 작용을 탐구하는 전임상 연구가 필수적입니다. 이 작업은 선택된 버섯의 자실체 내에 포함된 용해성 β글루칸을 회수하는 데 필요한 수많은 분리 및 정제 단계를 설명합니다. 성공적으로 정제되면 미세아교세포가 활성화되어 염증 표현형이 향상됩니다. 마우스 교모세포종 세포(GL261)를 이전에 이러한 추출물로 처리한 다른 미세아교세포 조절 배지로 코팅한 다음 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 평가합니다. 흥미롭게도, 우리 연구실의 파일럿 연구 (데이터는 표시되지 않음)는 전 염증성 미세 아교 세포가 교 모세포종 세포뿐만 아니라 다른 암 세포주에서도 종양 세포 이동 및 침윤 특성을 늦출 수있는 방법을 밝혀 냈습니다. 이 다학제적 연구는 종양학 연구자들이 다양한 유형의 종양에서 면역 반응을 높일 수 있는 유망한 화합물을 테스트하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 가장 큰 과제 중 하나는 종양 미세 환경 내에서 강력한 면역 억제를 극복하는 것입니다. 면역 요법은 종양 세포에 대한 면역계 반응을 돌리는 효과적인 전략으로 부상했습니다. 신경아교종 관련 대식세포 및 미세아교세포(GAM)는 이러한 항염증 시나리오의 주요 동인입니다. 따라서 GAM에서 항암 반응을 향상시키는 것은 교모세포종 환자를 치료하기 위한 잠재적인 공동 보조 요법을 나타낼 수 있습니다. 그런 맥락에서 곰팡이 β글루칸 분자는 오랫동안 강력한 면역 조절제로 알려져 왔습니다. 선천성 면역 활동을 자극하고 치료 반응을 개선하는 능력이 설명되었습니다. 이러한 조절 기능은 부분적으로 패턴 인식 수용체에 결합하는 능력에 기인하며, 흥미롭게도 GAM에서 크게 표현됩니다. 따라서 이 작업은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 종양 반응을 향상시키기 위한 진균 β글루칸의 분리, 정제 및 후속 사용에 중점을 둡니다. 마우스 교모세포종(GL261) 및 미세아교세포(BV-2) 세포주는 현재 바이오 제약 산업에서 많이 사용되는 버섯에서 추출한 4가지 다른 진균 β글루칸(Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum)의 면역 조절 특성을 테스트하는 데 사용됩니다. 이들 화합물을 시험하기 위해, 교모세포종 세포에서의 증식 및 세포자멸사 활성화에 대한 사전 활성화된 미세아교세포-조건화 배지의 효과를 측정하기 위해 공동-자극 분석을 수행하였다.

β글루칸의 성공적인 정제 추출 및 정제 과정을 거쳐 P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus 의 자실체에서 얻은 MP, SMP 및 SβG의 질량은 표 1에 요약되어 있습니다. 진균으로부터 얻어진 MP, SMPs 및 SβGs의 기본 조성(총 탄수화물, β-글루칸 및 단백질)은 표 2에 묘사되어 있다. 이러한 결과는 프로토콜이 어떻게 SMP에서 많은 양의 단백...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

본 프로토콜은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 항종양 특성을 향상시키는 잠재적인 면역 조절 분자로서 4가지 다른 진균 β글루칸의 정제 단계 및 후속 연구를 설명합니다.

교모세포종에 대한 면역요법 전략으로서의 진균성 β-글루칸의 분리 및 정제

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

곰팡이 베타글루칸은 면역 체계의 중요한 조절제입니다. 순도 및 분리 프로토콜을 강화하는 것은 암 치료를 위한 공동 보조제로서의 잠재적인 역할을 주장하는 데 필수적입니다. 분자 생물학 및 단백질체 실험실에서 흔히 볼 수 있는 다양한 장치를 사용하여 4가지 다른 베타글루칸의 높은 수준을 달성했습니다.이 프로토콜은 뇌에서 가장 풍부한 상주 면역 세포인 미세아교세포에 대한 베타글루칸의 효과를 테스트하는 데 중점을 둡니다. 교모세포종에서 미세아교세포 표현형을 조절하는 것은 에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있다. Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum의 신선한 자실체를 증류수로 5 번 헹구어 가용성 버섯 다당류 또는 SMP의 추출을 시작합니다.그런 다음 세척 된 자실체를 기존의 공기 건조 오븐에서 섭씨 50도에서 약 24 시간 동안 완전히 건조시킨 후 블레이드 밀에서 분쇄하여 각 버섯에서 약 200g의 분말을 얻습니다. 다음으로, 1, 000 밀리리터의 증류수에 4 개의 버섯 분말 또는 MP 100 그램을 현탁시키고 섭씨 121도에서 15 분 동안 현탁액을 오토 클레이브한다. 실온에서 30 분 동안 배양 한 후, 생성 된 현탁액을 섭씨 4도에서 10 분 동안 6, 000 G에서 원심 분리한다.그런 다음 불용성 버섯 다당류 또는 IMP를 함유한 침전물을 공기 건조 오븐에서 섭씨 50도에서 24시간 동안 건조시킵니다. 침전물을 버리고 상층액을 회전 증발기에서 10회 농축한다. 다음으로, SMP를 함유 한 농축액을 섭씨 4도에서 밤새 에탄올로 침전시킨다.에탄올 현탁액을 섭씨 4도에서 15 분 동안 6, 000 G에서 원심 분리 한 후, 피펫으로 상층액을 버리고 펠렛을 80 % 에탄올로 3 회 세척 한 후 용해시키고 증류수로 세척한다. pH를 6.5 내지 7로 조정하고 온도를 섭씨 37도로 조절하고 현탁액을 각각 2 단위 및 4 단위의 알파-아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 처리하여 알파-글루칸을 가용화시킨다. 다음으로, pH를 8.0으로 조정하고 온도를 섭씨 50도로 조정하고 현탁액을 단백질 그램당 2.5 단위에 해당하는 알칼라제로 처리하여 단백질을 가용화시킨다.가수분해 후, 가수분해물을 원심분리하고 상등액 농축액을 회전 증발기에서 5회 세척한다. 80% 에탄올을 첨가하여 상등액 농축액을 다시 침전시킨다. 저분자량 분자를 제거하기 위해, 침전물을 증류수에 가용화시키고, 12, 000 달톤 컷오프 셀룰로스 튜브 멤브레인을 사용하여 24시간 동안 증류수에서 투석한다.수용성 부분을 회수하고 동결 건조하여 가용성 베타글루칸 또는 S 베타-G를 생성합니다. 총 글루칸과 알파 글루칸을 별도로 평가합니다. 결과 베타-글루칸 값을 총 글루칸 값과 알파-글루칸 값의 차이로 측정합니다.UV 가시광선 분광광도계를 사용하여 S beta-G UV 스펙트럼을 얻기 위해, 증류수 중 각 S beta-G의 밀리리터당 1.0 밀리그램을 제조하였다. 샘플을 석영 큐벳으로 옮기고 실온에서 200-400 나노미터 영역에서 스캔합니다. UV 가시광선 검출기 및 SuperdexTM 200 10/300 GL 겔 여과 컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC를 통해 S beta-Gs 및 폴리머의 분자량의 균질성을 추정합니다.샘플의 적외선 스펙트럼을 푸리에 변환 적외선 또는 FTIR 분광계에 4, 000 내지 500 센티미터 범위로 기록한다. P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum 및 H.erinaceus에서 분리된 4가지 다른 베타글루칸의 밀리리터당 0.2밀리그램 농도로 BV2 미세아교세포 세포를 72시간 동안 코팅하여 미세아교세포를 활성화합니다. 72 시간 후, 피펫으로 상청액을 수집하고 나머지 부피를 0.20 마이크로 미터 주사기 필터를 통과시킵니다.그런 다음 상청액을 섭씨 영하 80도에서 최소 24시간 동안 동결합니다. GL 261을 사전 활성화된 미세아교세포 조절 배지로 처리하려면 250마이크로리터의 베타글루칸 처리된 소교세포 배지를 80% 융합성 GL 261 세포에 72시간 동안 추가합니다. 72시간 후에 배지를 폐기하십시오.상이한 S beta-Gs의 UV 스펙트럼은 260 및 280 나노미터에서 UV 흡수 피크를 나타내지 않았으며, 이는 S beta-Gs가 핵산 및 단백질이 결여되어 있음을 나타낸다. HPLC 크로마토그램은 P.ostreatus의 경우 10.9분, lucidum의 경우 10.5분, P.djamor의 경우 11.3분, H.erinaceus의 경우 8.20분에서 주요 날카롭고 단일 피크로 우수한 균질성을 보였으며, 이는 분획이 단일 중합체와 일치함을 시사합니다. FTIR 스펙트럼은 공유 다당류 결합에 해당하는 분자 진동을 측정했습니다.SS beta-Gs는 최소한의 단백질과 결합 된 탄수화물로 구성되어 있음을 보여주었습니다. S 베타-G의 단당류 프로파일을 분석한 HPTLC 및 GC-MS는 다량의 D-포도당, 소량의 D-갈락토오스 및 D-만노스, D-자일로스, D-람노스, D-푸코오스 및 L-아라비노스의 미량의 존재를 밝혀냈습니다. ImageJ 소프트웨어의 사내 스크립트를 사용하여 각 형광 채널에 대한 포지티브 픽셀 수를 정량화했습니다.스크립트는 각 형광단의 강도에 대한 임계값으로 제어 샘플을 사용하고 픽셀 수를 제공했습니다. 상이한 실험 조건 후에 각 마커에 대한 발현을 나타내었다. 흥미롭게도, GL 261은 상이한 미세아교세포 조절 배지에 노출되었을 때 종양 증식과 관련하여 유의한 차이를 겪지 않았다.그러나, P.djamor와 H.erinaceus는 절단된 카스파제-3에서 각각 약 6배 및 9배 증가의 강력한 유도를 보였다. 베타글루칸의 고급 순도를 보장하는 것은 이 프로토콜에 필수적입니다. 이 프로토콜은 분광 광도계, HPLC와 같은 고급 장비를 사용합니다.또는 FITR. 이러한 도구를 사용하면 연구 결과의 견고성이 향상됩니다. 우리는 미세아교세포에 대한 베타글루칸의 효과를 자신 있게 분석하고 보다 확실한 결과를 얻을 수 있습니다.시간과 세계의 한계로 인해 우리는 소교세포에 대한 베타글루칸 연구로 프로토콜을 제한했습니다. 그러나, 대식세포 또는 T 세포와 같은 면역계로부터의 다른 세포들은 이 프로토콜 동안 용이하게 될 수 있다. 처음으로 이러한 프로토콜은 두 가지 다른 지식 영역을 결합합니다.첫째, 특정 제품을 정제하기 위한 생명공학적 절차의 사용, 둘째, 면역 조절 특성을 테스트하기 위한 세포 배양 기술의 사용.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

연구

신경과학

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

성인 얼룩말 물고기를 사용하여 학습 및 메모리 연구에서 인지 평가를위한 연관 학습 도구로 셔틀 박스 분석

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

병아리 배아 뇌를 모델로 사용하여 인간 교모세포종 세포 행동 연구

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

저자 스포트라이트: 인간 교모세포종 세포 행동의 In vivo 및 Ex Vivo 분석을 위한 모델로 병아리 배아 뇌 사용  

병아리 배아 뇌를 인간 교모세포종 세포 행동의 생체 내 및 생체 외 분석을 위한 모델로 사용

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...