Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Vasiliki Economopoulos for hennes interne manus for å måle fuluorescenssignalet i ImageJ. Vi vil også takke CITIUS (Universitetet i Sevilla) og alt deres personell for deres støtte under demonstrasjonen. Dette arbeidet ble støttet av den spanske FEDER I + D + i-USE, US-1264152 fra Universitetet i Sevilla, og Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

De fire forskjellige soppvariantene beskrevet i denne protokollen ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Isolering av sopp- β-glukaner
<ol><li>Ekstraksjon og isolering av løselige sopppolysakkarider MERK: Løselige sopppolysakkarider (SMP) ble oppnådd i henhold til prosedyren skjematisk vist i figur 1.<ol><li>Skyll forsiktig fersk P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus og ...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Dette arbeidet beskriver bruken av veletablerte teknikker for å kunne isolere, rense og karakterisere innholdet av SβG fra fire forskjellige sopp. Resultatene viste hvordan etter varmtvannsekstraksjon av SMP, oppnådd fra P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus, etterfulgt av hydrolytisk behandling med α-amylase, glukosidase og protease, ble innholdet av α-glukan og protein redusert, og dermed betydelig beriket mengden rene SβGs.
Til tross f...

Til tross for fremkomsten av nye prestasjoner innen nevro-onkologi, forblir forventet levetid for glioblastompasienter mager. Gullstandardbehandlinger mot hjernesvulster er basert på sammenslåing av kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men i det siste tiåret har immunterapi dukket opp som en kraftig strategi for å behandle ulike typer kreft1. Dermed har muligheten for å utnytte kroppens immunrespons mot tumorceller nylig blitt den fjerde søylen i onkologi.
Det har lenge vært kjent at en av de største utfordringene i feltet er å overvinne den sterke immunsuppresjonen som finnes i tumormikromiljøet2. Spesielt i tilfelle av glioblastom, en av de vanligste og mest aggressive former for hjernekreft, unraveling viktige veier som orkestrerer slike pro-tumorale scenarier og finne nye forbindelser som kan motvirke immunsystemets deprimerende respons, kan bane vei for fremtidige terapier mot denne uhelbredelige sykdommen.
Hjernen har sine egne immunsystemceller, og den mest aktuelle celletypen er mikroglia. Disse cellene har vist seg å ha en ganske kompleks oppførsel på tvers av ulike sentrale sykdommer3. I tilfelle av primære hjernesvulster (f.eks. Glioblastom), blir disse cellene skiftet mot en antiinflammatorisk fenotype som støtter tumorceller for å kolonisere hjerneparenkymet3. Tallrike publikasjoner har forbedret hovedrollen til disse cellene under tumorprogresjon. En av hovedårsakene til dette er at gliomassosiert mikroglia og infiltrerte makrofager (GAM) står for en tredjedel av den totale tumormassen, noe som tyder på den utvetydige innflytelsen av deres aktiveringstilstander under hjernesvulstprogresjon 4,5.
På den måten har sopp- β glukaner blitt beskrevet som potente molekyler som utløser effektive immunresponser, inkludert fagocytose og proinflammatoriske faktorer, noe som fører til eliminering av skadelige midler 6,7,8,9,10. Fungal β-glukaner har generelt blitt studert ved hjelp av ekstrakter fra forskjellige soppdeler. Tildelingen av spesifikke effekter krever imidlertid rensing for å unngå tvetydigheter og for å kunne forstå virkningsmekanismen til slike molekyler som immunmodulerende midler8.
I dette arbeidet renses løselige β-glukaner fra fruktkroppen til fire forskjellige sopper, regelmessig brukt som spiselige (Pleurotus ostreatus og Pleurotus djamor) og som medisinske (Ganoderma lucidum og Hericium erinaceus) sopp. Spesielt har disse fire soppene stor nytte i næringsmiddel- og farmasøytisk industri og ble produsert innenfor en miljøvennlig sirkulær økonomi i en kommersiell bedrift (se Materialliste).
For å legge grunnlaget for fremtidig bruk av sopp- β-glukaner i hjernekreftbehandlinger, er veldefinerte rensestrategier og prekliniske studier som dykker ned i deres antatte interaksjon med immunsystemceller avgjørende for å evaluere deres potensielle rolle som antitumormediatorer. Dette arbeidet beskriver de mange trinnene av isolasjon og rensing som trengs for å hente de løselige β-glukanene som finnes i fruktkroppene til den valgte soppen. Når de er vellykket renset, aktiveres mikrogliaceller for å forbedre deres inflammatoriske fenotype. Glioblastomceller fra mus (GL261) er belagt med et annet mikrogliabetinget medium, som tidligere er behandlet med disse ekstraktene, og deretter evalueres effekten på tumorcellenes oppførsel. Interessant nok har pilotstudier fra laboratoriet vårt (data ikke vist) avdekket hvordan pro-inflammatorisk mikroglia kan bremse tumorcellemigrasjon og invasjonsegenskaper, ikke bare i glioblastomceller, men også i andre kreftcellelinjer. Dette tverrfaglige arbeidet kan gi et nyttig verktøy for onkologiske forskere for å teste lovende forbindelser som kan øke immunresponsen i mange forskjellige typer svulster.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

En av de største utfordringene ved å utvikle effektive terapier mot glioblastom er å overvinne den sterke immunundertrykkelsen i tumormikromiljøet. Immunterapi har dukket opp som en effektiv strategi for å snu immunsystemresponsen mot tumorceller. Gliomassosierte makrofager og mikroglia (GAM) er viktige drivere for slike antiinflammatoriske scenarier. Derfor kan forbedring av anti-kreftresponsen i GAMs representere en potensiell co-adjuvant behandling for å behandle glioblastompasienter. På den måten har sopp- β-glukanmolekyler lenge vært kjent som potente immunmodulatorer. Deres evne til å stimulere den medfødte immunaktiviteten og forbedre behandlingsresponsen er beskrevet. Disse modulerende egenskapene tilskrives delvis deres evne til å binde seg til mønstergjenkjenningsreseptorer, som interessant nok uttrykkes sterkt i GAM. Dermed er dette arbeidet fokusert på isolering, rensing og etterfølgende bruk av sopp- β-glukaner for å forbedre tumoricid respons av mikroglia mot glioblastomceller. Musen glioblastom (GL261) og microglia (BV-2) cellelinjer brukes til å teste immunmodulerende egenskaper av fire forskjellige sopp β-glukaner ekstrahert fra sopp tungt brukt i dagens biofarmasøytiske industri: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum. For å teste disse forbindelsene ble det utført kostimuleringsanalyser for å måle effekten av et preaktivert mikrogliabetinget medium på proliferasjon og apoptoseaktivering i glioblastomceller.

Vellykket rensing av β-glukaner Massen av MP, SMP og SβG oppnådd fra fruktlegemer av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus etter ekstraksjons- og renseprosessen er oppsummert i tabell 1. Den grunnleggende sammensetningen (totale karbohydrater, β-glukaner og protein) av MP, SMP og SβG oppnådd fra soppene er vist i tabell 2. Disse resultatene viser hvordan protokollen tillot gjenfinning av en stor mengde proteininn...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Den foreliggende protokollen beskriver rensetrinnene og påfølgende studier av fire forskjellige sopp- β-glukaner som potensielle immunmodulerende molekyler som forbedrer de antitumorale egenskapene til mikroglia mot glioblastomceller.

Isolering og rensing av sopp-β-glukan som en immunterapistrategi for glioblastom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Sopp-betaglukaner er viktige modulatorer av immunsystemet. Styrking av renhets- og isolasjonsprotokollene er avgjørende for å hevde deres potensielle rolle som medadjuvanser for kreftbehandling. En høy grad av fire forskjellige betaglukaner ble oppnådd ved bruk av forskjellige enheter som ofte finnes i molekylærbiologiske og proteomiske laboratorier.Denne protokollen fokuserer på å teste effekten av betaglukaner på mikroglia, hjernens mest tallrike bosatt immuncelle. Modulering av mikrogliafenotypen i glioblastom kan gi viktig innsikt i. Begynn ekstraksjonen av løselige sopppolysakkarider eller SMP ved å skylle friske fruktlegemer av Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum med destillert vann fem ganger.Tørk deretter de vaskede fruktkroppene helt ved 50 grader Celsius i en konvensjonell lufttørkeovn i omtrent 24 timer før du maler dem i en bladmølle, og oppnår omtrent 200 gram pulver fra hver sopp. Deretter suspenderes 100 gram av alle fire sopppulver eller MP i 1.000 ml destillert vann og autoklav suspensjonen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Etter 30 minutters inkubering ved romtemperatur, sentrifuge den resulterende suspensjonen ved 6.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Tørk deretter bunnfallet som inneholder uoppløselige sopppolysakkarider eller IMPs ved 50 grader Celsius i en lufttørkeovn i 24 timer. Kast bunnfallet og konsentrer supernatanten 10 ganger i en roterende fordamper. Deretter felles konsentratet som inneholder SMP med etanol over natten ved fire grader Celsius.Etter sentrifugering av etanolsuspensjonen ved 6.000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius, kast supernatanten med en pipette og vask pelleten tre ganger med 80% etanol før den oppløses og destilleres vann. Juster pH til 6,5 til 7 og temperaturen til 37 grader Celsius og solubiliser alfa-glukanene ved å behandle suspensjonen med henholdsvis to enheter og fire enheter alfa-amylase og glukoamylase. Deretter justeres pH til 8,0 og temperatur til 50 grader Celsius og solubiliser proteinene ved å behandle suspensjonen med alkalase tilsvarende 2,5 enheter per gram protein.Etter hydrolyse, sentrifuge hydrolysatet og rengjør supernatantkonsentratet fem ganger i en roterende fordamper. Utfell supernatantkonsentratet igjen ved å tilsette 80 % etanol. For å fjerne molekyler med lav molekylvekt, solubiliser bunnfallet i destillert vann og dialyser det i destillert vann i 24 timer ved bruk av 12.000 Dalton cutoff celluloserørmembraner.Gjenvinn den vannløselige delen og frysetørke den for å produsere løselige beta-glukaner eller S beta-Gs. Evaluer de totale glukanene og alfa-glukanene separat. Mål de resulterende beta-glukanverdiene som forskjellen mellom de totale glukan- og alfa-glukanverdiene.For å oppnå S beta-G UV-spektra ved hjelp av et UV-synlig spektrofotometer, klargjør 1,0 milligram per milliliter av hver S beta-G i destillert vann. Overfør prøven til en kvartskuvette og skann ved romtemperatur i området 200 til 400 nanometer. Estimere homogeniteten av S beta-G og molekylvekten av polymerer etter størrelse, ekskluderingskromatografi eller SEC ved hjelp av en høy ytelse væskekromatografi eller HPLC-system utstyrt med en UV synlig detektor og en Superdex TM 200 10/300 GL gelfiltreringskolonne.Registrer prøvens infrarøde spektra på et Fourier-transform infrarødt eller FTIR-spektrometer i området 4.000 til 500 per centimeter. Aktiver mikroglia ved å belegge BV2 microglia-cellene i 72 timer med 0,2 milligram per milliliter konsentrasjon av fire forskjellige betaglukaner isolert fra P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum og H.erinaceus. Etter 72 timer, samle supernatanten med en pipette og pass det gjenværende volumet gjennom et 0,20 mikrometer sprøytefilter.Frys deretter supernatanten ved minus 80 grader Celsius i minst 24 timer. For å behandle GL 261 med det preaktiverte mikrogliabetingede mediet, tilsett 250 mikroliter betaglukanbehandlet mikrogliamedium til 80 % konfluente GL 261-celler i 72 timer. Kast mediet etter 72 timer.UV-spektra av de forskjellige S beta-G-ene viste ikke UV-absorpsjonstopper ved 260 og 280 nanometer, noe som indikerer at S beta-G manglet nukleinsyrer og proteiner. HPLC-kromatogrammene viste god homogenitet med en hovedskarp og enkel topp ved 10,9 minutter for P.ostreatus, 10,5 minutter for lucidum, 11,3 minutter for P.djamor og 8,20 minutter for H.erinaceus, noe som tyder på at fraksjonen er konsistent med homopolymerer. FTIR-spektrene målte molekylære vibrasjoner tilsvarende kovalente polysakkaridbindinger.Den viste at SS beta-G besto av karbohydrater konjugert med et minimalt protein. HPTLC og GC-MS som analyserte monosakkaridprofilen til S beta-G avslørte tilstedeværelsen av en stor mengde D-glukose, mindre mengder D-galaktose og D-mannose, og et spor av D-xylose, D-rhamnose, D-fukose og L-arabinose. Ved hjelp av et internt skript i ImageJ-programvaren ble antall positive piksler for hver fluorescerende kanal kvantifisert.Skriptet brukte kontrollprøver som en terskel for intensiteten til hver fluorofor og ga antall piksler. Det indikerte uttrykket for hver markør etter forskjellige eksperimentelle forhold. Interessant nok led GL 261 ikke signifikante forskjeller med hensyn til tumorproliferasjon ved eksponering for de forskjellige mikrogliabetingede mediene.Imidlertid viste P.djamor og H.erinaceus sterk induksjon av henholdsvis en omtrent seks ganger og ni ganger økning i spaltet caspase-3. Å sikre en høygradig renhet av betaglukaner er avgjørende for denne protokollen. Denne protokollen bruker avansert utstyr som spektrofotometer, HPLC.eller FITR. Bruk av disse verktøyene forbedrer robustheten til funnene våre. Vi kan trygt analysere effekten av beta-glukaner på mikroglia og oppnå mer sikre resultater.På grunn av tids- og verdensbegrensning har vi begrenset vår protokoll til studier av betaglukaner på mikrogliaceller. Imidlertid kan andre celler fra immunsystemet som makrofager eller T-celler lett være lett under denne protokollen. For første gang kombinerer disse protokollene to forskjellige kunnskapsområder.For det første, bruk av bioteknologisk prosedyre for å rense spesifikke produkter, og for det andre, bruk av cellekulturteknikker for å teste deres immunmodulerende egenskaper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolasjon og utvidelse av Human glioblastoma multiforme kreftceller Bruke Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metode for opptak Intracellulær spenningsreaksjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer og interneurons til lys stimuli<em&gt; I Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning som et mål for læring og minne

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering Motor Axon navigasjon og kvantifisering av Axon Arborization i Mouse embryoer bruker lys ark fluorescens mikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et assosiativt læringsverktøy for kognitiv vurdering i lærings- og minnestudier ved hjelp av voksen sebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypiske kulturer av voksen human cortex som en ex vivo-modell for human stamcelletransplantasjon og validering

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Bruk av kyllingembryohjerne som en modell for å studere menneskelig glioblastomcelleatferd

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Forfatter i søkelyset: Bruk av kyllingembryohjernen som en modell for in vivo og ex vivo analyser av human glioblastomcelleatferd  

Bruke Chick Embryo Brain som en modell for in vivo og ex vivo analyser av human glioblastomcelleadferd

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...