Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à Dra. Vasiliki Economopoulos por seu script interno para medir o sinal de fuluorescência no ImageJ. Gostaríamos também de agradecer ao CITIUS (Universidade de Sevilha) e a todo o seu pessoal pelo apoio durante a manifestação. Este trabalho foi apoiado pelo espanhol FEDER I + D + i-USE, US-1264152 da Universidade de Sevilha, e pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

As quatro diferentes variantes de cogumelos descritas neste protocolo foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Isolamento de β-glucanas fúngicas
<ol><li>Extração e isolamento de polissacarídeos solúveis de cogumelos OBS: Polissacarídeos solúveis de cogumelos (SMPs) foram obtidos de acordo com o procedimento esquematicamente mostrado na Figura 1.<ol><li>Enxaguar suavemente os corpos frutífero...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Este trabalho descreve o uso de técnicas bem estabelecidas para isolar, purificar e caracterizar com sucesso o conteúdo de SβGs de quatro fungos diferentes. Os resultados mostraram como após a extração em água quente das SMPs, obtidas de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguida de tratamento hidrolítico com α-amilase, glucosidase e protease, os teores de α-glucana e proteína foram reduzidos, enriquecendo significativamente a quantidade de SβGs puros.
...

Apesar do advento de novas conquistas no campo da neuro-oncologia, a expectativa de vida dos pacientes com glioblastoma permanece escassa. As terapias padrão-ouro contra tumores cerebrais são baseadas na fusão de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, na última década, a imunoterapia emergiu como uma poderosa estratégia para o tratamento de diferentes tipos decâncer1. Assim, a possibilidade de aproveitar a resposta imune do organismo contra as células tumorais tornou-se recentemente o quarto pilar da oncologia.
Há muito se sabe que um dos maiores desafios na área é superar a forte imunossupressão encontrada no microambientetumoral2. Particularmente, no caso do glioblastoma, uma das formas mais comuns e agressivas de câncer cerebral, desvendar caminhos-chave que orquestram tais cenários pró-tumorais e encontrar novos compostos que poderiam neutralizar a resposta depressiva do sistema imunológico pode abrir caminho para futuras terapias contra essa doença incurável.
O cérebro possui suas próprias células do sistema imunológico, e o tipo de célula mais relevante são a microglia. Comprovadamente, essas células têm um comportamento bastante complexo em diferentes doençascentrais3. No caso de tumores cerebrais primários (por exemplo, glioblastoma), essas células são deslocadas para um fenótipo anti-inflamatório que suporta as células tumorais para colonizar o parênquima cerebral3. Inúmeras publicações têm reforçado o papel importante dessas células durante a progressão tumoral. Uma das principais razões para isso é que a micróglia associada ao glioma e os macrófagos infiltrados (MAGs) respondem por um terço da massa tumoral total, sugerindo a influência inequívoca de seus estados de ativação durante a progressão do tumor cerebral 4,5.
Nesse sentido, os β-glucanos fúngicos têm sido descritos como moléculas potentes que desencadeiam respostas imunes efetivas, incluindo fagocitose e produção de fatores pró-inflamatórios, levando à eliminação de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Os β-glucanos fúngicos têm sido geralmente estudados usando extratos de diferentes partes do cogumelo. Entretanto, a atribuição de efeitos específicos requer sua purificação para evitar ambiguidades e poder compreender o mecanismo de ação de tais moléculas como agentes imunomoduladores8.
Neste trabalho, β-glucanas solúveis são purificadas do corpo frutífero de quatro diferentes cogumelos, regularmente empregados como cogumelos comestíveis (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinais (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). Em particular, estes quatro cogumelos têm uma grande utilização na indústria alimentar e farmacêutica e foram produzidos no âmbito de uma economia circular ecológica numa empresa comercial (ver Tabela de Materiais).
A fim de estabelecer as bases para o uso futuro de β-glucanas fúngicas em terapias de câncer cerebral, estratégias de purificação bem definidas e estudos pré-clínicos que se aprofundam em sua interação putativa com células do sistema imunológico são essenciais para avaliar seu papel potencial como mediadores antitumorais. Este trabalho descreve as inúmeras etapas de isolamento e purificação necessárias para recuperar os β-glucanos solúveis contidos nos corpos frutíferos do cogumelo selecionado. Uma vez purificadas com sucesso, as células da microglia são ativadas para melhorar seu fenótipo inflamatório. Células de glioblastoma de camundongo (GL261) são revestidas com um meio diferente condicionado por microglia, previamente tratado com esses extratos, e então seu efeito sobre o comportamento das células tumorais é avaliado. Curiosamente, estudos piloto de nosso laboratório (dados não mostrados) descobriram como a microglia pró-inflamatória pode retardar a migração de células tumorais e as propriedades de invasão não apenas em células de glioblastoma, mas também em outras linhagens de células cancerosas. Este trabalho multidisciplinar pode fornecer uma ferramenta útil para pesquisadores de oncologia testarem compostos promissores capazes de aumentar a resposta imune em muitos tipos diferentes de tumores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

Um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias eficazes contra o glioblastoma é superar a forte supressão imunológica dentro do microambiente tumoral. A imunoterapia tem emergido como uma estratégia eficaz para transformar a resposta do sistema imune contra as células tumorais. Macrófagos e micróglias associados à glioma (MAGs) são os principais impulsionadores desses cenários anti-inflamatórios. Portanto, aumentar a resposta anticancerosa em MAGs pode representar uma terapia coadjuvante potencial para tratar pacientes com glioblastoma. Nessa linha, as moléculas fúngicas de β-glucano têm sido conhecidas há muito tempo como potentes moduladores imunológicos. Sua capacidade de estimular a atividade imune inata e melhorar a resposta ao tratamento tem sido descrita. Essas características moduladoras são parcialmente atribuídas à sua capacidade de se ligar a receptores de reconhecimento de padrões, que, curiosamente, são muito expressos em GAMs. Assim, este trabalho está focado no isolamento, purificação e subsequente uso de β-glucanas fúngicas para aumentar a resposta tumoricida da microglia contra células de glioblastoma. As linhagens celulares de glioblastoma de camundongo (GL261) e microglia (BV-2) são usadas para testar as propriedades imunomoduladoras de quatro diferentes β-glucanas fúngicas extraídas de cogumelos fortemente utilizados na indústria biofarmacêutica atual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Para testar esses compostos, ensaios de co-estimulação foram realizados para medir o efeito de um meio pré-ativado condicionado por microglia sobre a proliferação e ativação da apoptose em células de glioblastoma.

Purificação bem sucedida de β-glucanas A massa de MP, SMPs e SβGs obtida dos corpos frutíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus após o processo de extração e purificação está resumida na Tabela 1. A composição básica (carboidratos totais, β-glucanos e proteínas) de MP, SMPs e SβGs obtidos dos fungos está representada na Tabela 2. Esses resultados mostram como o protocolo permitiu a recuperaçã...

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Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

O presente protocolo descreve as etapas de purificação e estudos subsequentes de quatro diferentes β-glucanos fúngicos como potenciais moléculas imunomoduladoras que aumentam as propriedades antitumorais da micróglia contra células de glioblastoma.

Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Os beta-glucanos fúngicos são importantes moduladores do sistema imunológico. Melhorar os protocolos de pureza e isolamento é essencial para afirmar seu papel potencial como coadjuvantes para a terapia do câncer. Um alto grau de quatro diferentes beta-glucanas foi obtido usando vários dispositivos comumente encontrados em laboratórios de biologia molecular e proteômica.Este protocolo concentra-se em testar os efeitos dos beta-glucanos na microglia, a célula imunitária residente mais abundante do cérebro. A modulação do fenótipo da micróglia no glioblastoma pode produzir informações importantes sobre o assunto. Comece a extração de polissacarídeos solúveis de cogumelos ou SMPs enxaguando corpos frutíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum com água destilada cinco vezes.Em seguida, seque completamente os corpos frutíferos lavados a 50 graus Celsius em um forno de secagem convencional ao ar por aproximadamente 24 horas antes de moê-los em um moinho de lâminas obtendo cerca de 200 gramas de pó de cada cogumelo. Em seguida, suspenda 100 gramas de todos os quatro pós de cogumelos ou MP em 1.000 mililitros de água destilada e autoclave a suspensão a 121 graus Celsius por 15 minutos. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugar a suspensão resultante a 6.000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, seque o precipitado contendo polissacarídeos insolúveis de cogumelos ou IMPs a 50 graus Celsius em um forno de secagem ao ar por 24 horas. Descarte o precipitado e concentre o sobrenadante 10 vezes em um evaporador rotativo. Em seguida, precipitar o concentrado contendo SMPs com etanol durante a noite a quatro graus Celsius.Depois de centrifugar a suspensão de etanol a 6.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius, descartar o sobrenadante com uma pipeta e lavar o pellet três vezes com etanol 80% antes de dissolvê-lo e água destilada. Ajustar o pH para 6,5 a 7 e a temperatura para 37 graus Celsius e solubilizar os alfa-glucanos tratando a suspensão com duas unidades e quatro unidades de alfa-amilase e glucoamilase, respectivamente. Em seguida, ajuste o pH para 8,0 e a temperatura para 50 graus Celsius e solubilize as proteínas tratando a suspensão com alcalose equivalente a 2,5 unidades por grama de proteína.Após a hidrólise, centrifugar o hidrolisado e limpar o concentrado sobrenadante cinco vezes em um evaporador rotativo. Precipitar novamente o concentrado sobrenadante adicionando 80% de etanol. Para remover moléculas de baixo peso molecular, solubilizar o precipitado em água destilada e dialisá-lo na água destilada por 24 horas usando 12.000 membranas de tubos de celulose de corte Dalton.Recuperar a porção solúvel em água e secá-la por congelação para produzir beta-glucanas solúveis ou beta-Gs S. Avaliar separadamente as glucanas totais e as alfa-glucanas. Meça os valores de beta-glucana resultantes como a diferença entre os valores totais de glucano e alfa-glucano.Para obter os espectros UV S beta-G usando um espectrofotômetro UV visível, prepare 1,0 miligrama por mililitro de cada S beta-G em água destilada. Transfira a amostra para uma cubeta de quartzo e digitalize à temperatura ambiente na região de 200 a 400 nanômetros. Estimar a homogeneidade de S beta-Gs e peso molecular de polímeros por cromatografia de exclusão de tamanho ou SEC usando uma cromatografia líquida de alta eficiência ou sistema HPLC equipado com um detector UV visível e uma coluna de filtração em gel Superdex TM 200 10/300 GL.Registre os espectros infravermelhos da amostra em um espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier ou FTIR na faixa de 4.000 a 500 centímetros. Ativar a micróglia revestindo as células da micróglia BV2 por 72 horas com concentração de 0,2 miligramas por mililitro de quatro diferentes beta-glucanos isolados de P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum e H.erinaceus. Após 72 horas, coletar o sobrenadante com uma pipeta e passar o volume restante por um filtro de seringa de 0,20 micrômetro.Em seguida, congele o sobrenadante a 80 graus Celsius negativos por pelo menos 24 horas. Para tratar o GL 261 com o meio pré-ativado condicionado por microglia, adicione 250 microlitros de meio microglial tratado com beta-glucano a 80% de células GL 261 confluentes por 72 horas. Descarte o meio após 72 horas.Os espectros UV dos diferentes beta-Gs S não mostraram picos de absorção UV em 260 e 280 nanômetros, indicando que os beta-Gs S não possuíam ácidos nucléicos e proteínas. Os cromatogramas de HPLC mostraram boa homogeneidade com pico principal e único em 10,9 minutos para P.ostreatus, 10,5 minutos para lucidum, 11,3 minutos para P.djamor e 8,20 minutos para H.erinaceus, sugerindo que a fração é consistente com homopolímeros. Os espectros FTIR mediram as vibrações moleculares correspondentes às ligações polissacarídicas covalentes.Mostrou que os beta-Gs da SS eram compostos por carboidratos conjugados com um mínimo de proteína. HPTLC e GC-MS analisando o perfil de monossacarídeos de S beta-Gs revelaram a presença de uma grande quantidade de D-glicose, menores quantidades de D-galactose e D-manose, e um traço de D-xilose, D-ramnose, D-fucose e L-arabinose. Usando um script interno no software ImageJ, o número de pixels positivos para cada canal fluorescente foi quantificado.O script usou amostras de controle como um limiar para a intensidade de cada fluoróforo e forneceu o número de pixels. Indicou a expressão para cada marcador após diferentes condições experimentais. Curiosamente, o GL 261 não sofreu diferenças significativas quanto à proliferação tumoral na exposição aos diferentes meios condicionados pela micróglia.Entretanto, P.djamor e H.erinaceus mostraram forte indução de um aumento de aproximadamente seis e nove vezes na caspase-3 clivada, respectivamente. Garantir uma pureza de alto grau de beta-glucanas é essencial para este protocolo. Este protocolo utiliza equipamentos avançados como espectrofotômetro, HPLC.ou FITR. O uso dessas ferramentas aumenta a robustez de nossos achados. Podemos analisar com confiança os efeitos das beta-glucanas na micróglia e obter resultados mais confiáveis.Devido à limitação temporal e mundial, restringimos nosso protocolo ao estudo de beta-glucanos em células microgliais. No entanto, outras células do sistema imunológico, como macrófagos ou células T, podem ser facilmente facilmente durante este protocolo. Pela primeira vez, esses protocolos combinam duas áreas diferentes do conhecimento.Primeiro, o uso de procedimentos biotecnológicos para purificar produtos específicos e, segundo, o uso de técnicas de cultura celular para testar suas propriedades imunomoduladoras.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Neurociência

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay como uma ferramenta de aprendizagem associativa para avaliação cognitiva em estudos de aprendizagem e memória usando zebrafish adulto

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Culturas organotípicas do córtex humano adulto como modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Usando o cérebro do embrião de galinha como modelo para estudar o comportamento das células de glioblastoma humano

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Autor em destaque: Usando o cérebro do embrião de pintinho como modelo para análises in vivo e ex vivo do comportamento das células de glioblastoma humano  

Uso do Cérebro de Embriões de Pintinhos como Modelo para Análises In Vivo e Ex Vivo do Comportamento Celular de Glioblastoma Humano

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...