Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a la Dra. Vasiliki Economopoulos por su guión interno para medir la señal de fuluorescencia en ImageJ. También queremos agradecer al CITIUS (Universidad de Sevilla) y a todo su personal por su apoyo durante la demostración. Este trabajo ha contado con el apoyo de la empresa española FEDER I+D+i-USE, US-1264152 de la Universidad de Sevilla, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Las cuatro variantes diferentes de hongos descritas en este protocolo se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
1. Aislamiento de β-glucanos fúngicos
<ol><li>Extracción y aislamiento de polisacáridos solubles de hongos NOTA: Los polisacáridos solubles de hongos (SMP) se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento esquemáticamente mostrado en la Figura 1.<ol><li>Enjuague suavemente los cuerpos fruct...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Este trabajo describe el uso de técnicas bien establecidas para aislar, purificar y caracterizar con éxito el contenido de SβGs de cuatro hongos diferentes. Los resultados mostraron cómo después de la extracción con agua caliente de SMP, obtenida de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus, seguida de un tratamiento hidrolítico con α-amilasa, glucosidasa y proteasa, el contenido de α-glucano y proteína se redujo, enriqueciendo significativamente la cantidad de SβG ...

A pesar del advenimiento de nuevos logros en el campo de la neurooncología, la esperanza de vida de los pacientes con glioblastoma sigue siendo escasa. Las terapias estándar de oro contra los tumores cerebrales se basan en la fusión de cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, en la última década, la inmunoterapia se ha convertido en una poderosa estrategia para tratar diferentes tipos de cáncer1. Por lo tanto, la posibilidad de aprovechar la respuesta inmune del cuerpo contra las células tumorales se ha convertido recientemente en el cuarto pilar de la oncología.
Desde hace tiempo se sabe que uno de los mayores desafíos en el campo es superar la fuerte inmunosupresión que se encuentra dentro del microambiente tumoral2. En particular, en el caso del glioblastoma, una de las formas más comunes y agresivas de cáncer cerebral, desentrañar las vías clave que orquestan tales escenarios protumorales y encontrar nuevos compuestos que podrían contrarrestar la respuesta deprimente del sistema inmunológico podría allanar el camino para futuras terapias contra esta enfermedad incurable.
El cerebro posee sus propias células del sistema inmunológico, y el tipo de célula más relevante es la microglía. Se ha demostrado que estas células tienen un comportamiento bastante complejo en diferentes enfermedades centrales3. En el caso de los tumores cerebrales primarios (por ejemplo, glioblastoma), estas células se desplazan hacia un fenotipo antiinflamatorio que apoya a las células tumorales para colonizar el parénquima cerebral3. Numerosas publicaciones han mejorado el papel principal de estas células durante la progresión tumoral. Una de las principales razones de esto es que la microglía asociada al glioma y los macrófagos infiltrados (GAMs) representan un tercio de la masa tumoral total, lo que sugiere la influencia inequívoca de sus estados de activación durante la progresión del tumor cerebral 4,5.
En ese sentido, los β-glucanos fúngicos han sido descritos como moléculas potentes que desencadenan respuestas inmunes efectivas, incluyendo fagocitosis y producción de factores proinflamatorios, lo que lleva a la eliminación de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Los β-glucanos fúngicos generalmente se han estudiado utilizando extractos de diferentes partes de hongos. Sin embargo, la atribución de efectos específicos requiere su purificación para evitar ambigüedades y poder comprender el mecanismo de acción de tales moléculas como agentes inmunomoduladores8.
En este trabajo, los β-glucanos solubles se purifican del cuerpo fructífero de cuatro hongos diferentes, empleados regularmente como hongos comestibles (Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor) y medicinales (Ganoderma lucidum y Hericium erinaceus). En particular, estos cuatro hongos tienen un gran uso en la industria alimentaria y farmacéutica y se produjeron dentro de una economía circular respetuosa con el medio ambiente en una empresa comercial (ver Tabla de materiales).
Con el fin de sentar las bases para el uso futuro de β-glucanos fúngicos en terapias contra el cáncer cerebral, las estrategias de purificación bien definidas y los estudios preclínicos que profundizan en su supuesta interacción con las células del sistema inmune son esenciales para evaluar su papel potencial como mediadores antitumorales. Este trabajo describe los numerosos pasos de aislamiento y purificación necesarios para recuperar los β-glucanos solubles contenidos dentro de los cuerpos fructíferos del hongo seleccionado. Una vez purificadas con éxito, las células microgliales se activan para mejorar su fenotipo inflamatorio. Las células de glioblastoma de ratón (GL261) se recubren con un medio diferente condicionado por microglía, previamente tratado con estos extractos, y luego se evalúa su efecto sobre el comportamiento de las células tumorales. Curiosamente, los estudios piloto de nuestro laboratorio (datos no mostrados) han descubierto cómo la microglía proinflamatoria puede retrasar la migración de células tumorales y las propiedades de invasión no solo en las células de glioblastoma sino también en otras líneas celulares cancerosas. Este trabajo multidisciplinario puede proporcionar una herramienta útil para que los investigadores oncológicos prueben compuestos prometedores capaces de aumentar la respuesta inmune en muchos tipos diferentes de tumores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de terapias efectivas contra el glioblastoma es superar la fuerte supresión inmune dentro del microambiente tumoral. La inmunoterapia se ha convertido en una estrategia eficaz para convertir la respuesta del sistema inmunitario en contra de las células tumorales. Los macrófagos asociados al glioma y la microglía (GAM) son los principales impulsores de tales escenarios antiinflamatorios. Por lo tanto, mejorar la respuesta anticancerosa en los GAM puede representar una posible terapia coadyuvante para tratar a los pacientes con glioblastoma. En ese sentido, las moléculas fúngicas de β-glucano se conocen durante mucho tiempo como potentes moduladores inmunes. Se ha descrito su capacidad para estimular la actividad inmune innata y mejorar la respuesta al tratamiento. Esas características moduladoras se atribuyen en parte a su capacidad para unirse a los receptores de reconocimiento de patrones, que, curiosamente, se expresan en gran medida en los GAM. Por lo tanto, este trabajo se centra en el aislamiento, purificación y posterior uso de β-glucanos fúngicos para mejorar la respuesta tumoricida de la microglía contra las células de glioblastoma. Las líneas celulares de glioblastoma de ratón (GL261) y microglia (BV-2) se utilizan para probar las propiedades inmunomoduladoras de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes extraídos de hongos muy utilizados en la industria biofarmacéutica actual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum. Para probar estos compuestos, se realizaron ensayos de coestimulación para medir el efecto de un medio preactivado condicionado por microglía sobre la proliferación y la activación de la apoptosis en las células de glioblastoma.

Purificación exitosa de β-glucanos La masa de MP, SMPs y SβGs obtenida de cuerpos fructíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus después del proceso de extracción y purificación se resume en la Tabla 1. La composición básica (carbohidratos totales, β-glucanos y proteínas) de MP, SMPs y SβGs obtenidos de los hongos se representa en la Tabla 2. Estos resultados muestran cómo el protocolo permitió la re...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

El presente protocolo describe los pasos de purificación y los estudios posteriores de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes como moléculas inmunomoduladoras potenciales que mejoran las propiedades antitumorales de la microglía contra las células de glioblastoma.

Aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Los betaglucanos fúngicos son moduladores importantes del sistema inmunológico. Mejorar la pureza y los protocolos de aislamiento es esencial para afirmar su papel potencial como coadyuvantes para la terapia del cáncer. Se logró un alto grado de cuatro beta-glucanos diferentes utilizando varios dispositivos que se encuentran comúnmente en biología molecular y laboratorios proteómicos.Este protocolo se centra en probar los efectos de los beta-glucanos en la microglía, la célula inmune residente más abundante del cerebro. La modulación del fenotipo de microglía en el glioblastoma puede proporcionar información importante. Comience la extracción de polisacáridos solubles de hongos o SMP enjuagando los cuerpos fructíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum con agua destilada cinco veces.Luego seque completamente los cuerpos fructíferos lavados a 50 grados centígrados en un horno de secado al aire convencional durante aproximadamente 24 horas antes de molerlos en un molino de cuchillas obteniendo aproximadamente 200 gramos de polvo de cada hongo. A continuación, suspenda 100 gramos de los cuatro polvos de hongos o MP en 1, 000 mililitros de agua destilada y autoclave la suspensión a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar la suspensión resultante a 6, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Luego seque el precipitado que contiene polisacáridos de hongos insolubles o IMP a 50 grados centígrados en un horno de secado al aire durante 24 horas. Deseche el precipitado y concentre el sobrenadante 10 veces en un evaporador rotativo. A continuación, precipite el concentrado que contiene SMP con etanol durante la noche a cuatro grados centígrados.Después de centrifugar la suspensión de etanol a 6, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante con una pipeta y lave el pellet tres veces con etanol al 80% antes de disolverlo y destilar agua. Ajustar el pH a 6,5 a 7 y la temperatura a 37 grados centígrados y solubilizar los alfa-glucanos tratando la suspensión con dos unidades y cuatro unidades de alfa-amilasa y glucoamilasa respectivamente. A continuación, ajuste el pH a 8.0 y la temperatura a 50 grados centígrados y solubilice las proteínas tratando la suspensión con alcalasa equivalente a 2.5 unidades por gramo de proteína.Después de la hidrólisis, centrifugar el hidrolizado y limpiar el concentrado sobrenadante cinco veces en un evaporador rotativo. Precipitar el concentrado sobrenadante de nuevo añadiendo 80% de etanol. Para eliminar moléculas de bajo peso molecular, solubilice el precipitado en agua destilada y dialícelo en el agua destilada durante 24 horas utilizando 12, 000 membranas de tubos de celulosa de corte Dalton.Recupere la porción soluble en agua y liofilifíquela para producir beta-glucanos solubles o S beta-Gs. Evalúe los glucanos totales y los alfa-glucanos por separado. Mida los valores de beta-glucano resultantes como la diferencia entre los valores totales de glucano y alfa-glucano.Para obtener los espectros UV S beta-G usando un espectrofotómetro UV visible, prepare 1.0 miligramo por mililitro de cada S beta-G en agua destilada. Transfiera la muestra a una cubeta de cuarzo y escanee a temperatura ambiente en la región de 200 a 400 nanómetros. Estimar la homogeneidad de S beta-Gs y el peso molecular de los polímeros por cromatografía de exclusión de tamaño o SEC utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución o HPLC equipado con un detector visible UV y una columna de filtración de gel Superdex TM 200 10/300 GL.Registre los espectros infrarrojos de la muestra en un espectrómetro infrarrojo o FTIR por transformada de Fourier en el rango de 4.000 a 500 centímetros. Active la microglía recubriendo las células de microglía BV2 durante 72 horas con 0,2 miligramos por mililitro de concentración de cuatro betaglucanos diferentes aislados de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus. Después de 72 horas, recoja el sobrenadante con una pipeta y pase el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 micrómetros.Luego congele el sobrenadante a menos 80 grados centígrados durante al menos 24 horas. Para tratar GL 261 con el medio acondicionado de microglía preactivado, agregue 250 microlitros de medio microglial tratado con beta-glucano a 80% de células GL 261 confluentes durante 72 horas. Deseche el medio después de 72 horas.Los espectros UV de los diferentes S beta-G no mostraron picos de absorción UV a 260 y 280 nanómetros, lo que indica que los S beta-G carecían de ácidos nucleicos y proteínas. Los cromatogramas HPLC mostraron una buena homogeneidad con un pico principal agudo y único a los 10,9 minutos para P.ostreatus, 10,5 minutos para lucidum, 11,3 minutos para P.djamor y 8,20 minutos para H.erinaceus, lo que sugiere que la fracción es consistente con los homopolímeros. Los espectros FTIR midieron las vibraciones moleculares correspondientes a los enlaces polisacáridos covalentes.Mostró que SS beta-Gs comprendía carbohidratos conjugados con una proteína mínima. HPTLC y GC-MS analizando el perfil de monosacáridos de S beta-Gs revelaron la presencia de una gran cantidad de D-glucosa, cantidades más pequeñas de D-galactosa y D-manosa, y un rastro de D-xilosa, D-ramnosa, D-fucosa y L-arabinosa. Usando un script interno en el software ImageJ, se cuantificó el número de píxeles positivos para cada canal fluorescente.El script utilizó muestras de control como umbral para la intensidad de cada fluoróforo y proporcionó el número de píxeles. Indicó la expresión para cada marcador después de diferentes condiciones experimentales. Curiosamente, GL 261 no sufrió diferencias significativas con respecto a la proliferación tumoral en la exposición a los diferentes medios condicionados por la microglía.Sin embargo, P.djamor y H.erinaceus mostraron una fuerte inducción de un aumento de aproximadamente seis y nueve veces en la caspasa-3 escindida respectivamente. Garantizar una pureza de alto grado de beta-glucanos es esencial para este protocolo. Este protocolo utiliza equipos avanzados como espectrofotómetro, HPLC.o FITR. El uso de estas herramientas mejora la solidez de nuestros hallazgos. Podemos analizar con confianza los efectos de los beta-glucanos en la microglía y obtener resultados más seguros.Debido a la limitación de tiempo y mundo, hemos restringido nuestro protocolo al estudio de beta-glucanos en células microgliales. Sin embargo, otras células del sistema inmune, como los macrófagos o las células T, pueden ser fácilmente fáciles durante este protocolo. Por primera vez, estos protocolos combinan dos áreas de conocimiento diferentes.En primer lugar, el uso de procedimientos biotecnológicos para purificar productos específicos, y en segundo lugar, el uso de técnicas de cultivo celular para probar sus propiedades inmunomoduladoras.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Investigación

Neurociencias

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila condicionamiento del corte como una medida de aprendizaje y memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay como herramienta de aprendizaje asociativo para la evaluación cognitiva en estudios de aprendizaje y memoria utilizando pez cebra adulto

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Cultivos organotípicos de corteza humana adulta como modelo ex vivo para el trasplante y validación de células madre humanas

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Uso del cerebro de embrión de pollo como modelo para estudiar el comportamiento de las células de glioblastoma humano

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Autor destacado: Uso del cerebro de embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano  

Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...