Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Vi vill tacka Dr Vasiliki Economopoulos för hennes interna manus för att mäta fuluorescenssignalen i ImageJ. Vi vill också tacka CITIUS (universitetet i Sevilla) och all deras personal för deras stöd under demonstrationen. Detta arbete stöddes av den spanska FEDER I + D + i-USE, US-1264152 från universitetet i Sevilla och Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

De fyra olika svampvarianterna som beskrivs i detta protokoll erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
1. Isolering av svamp β-glukaner
<ol><li>Extraktion och isolering av lösliga svamppolysackarider Anmärkning: Lösliga svamppolysackarider (SMP) erhölls enligt det förfarande som schematiskt visas i figur 1.<ol><li>Skölj försiktigt färska fruktkroppar av P. ostreatus, P. djamor...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Detta arbete beskriver användningen av väletablerade tekniker för att framgångsrikt isolera, rena och karakterisera innehållet av SβG från fyra olika svampar. Resultaten visade hur efter varmvattenextraktion av SMP, erhållna från P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus, följt av hydrolytisk behandling med α-amylas, glukosidas och proteas, reducerades innehållet av α-glukan och protein, vilket avsevärt berikade mängden rena SβGs.
...

Trots tillkomsten av nya prestationer inom neuro-onkologi är livslängden för glioblastompatienter fortfarande mager. Guldstandardterapier mot hjärntumörer är baserade på sammanslagning av kirurgi, strålbehandling och kemoterapi. Men under det senaste decenniet har immunterapi framstått som en kraftfull strategi för att behandla olika typer av cancer1. Således har möjligheten att utnyttja kroppens immunsvar mot tumörceller nyligen blivit den fjärde pelaren i onkologi.
Det har länge varit känt att en av de största utmaningarna inom området är att övervinna den starka immunsuppression som finns inom tumörmikromiljön2. Särskilt när det gäller glioblastom, en av de vanligaste och aggressiva formerna av hjärncancer, kan unraveling viktiga vägar som orkestrerar sådana pro-tumörscenarier och hitta nya föreningar som kan motverka immunsystemets deprimerande respons bana väg för framtida terapier mot denna obotliga sjukdom.
Hjärnan har sina egna immunsystemceller, och den mest relevanta celltypen är mikroglia. Dessa celler har visat sig ha ett ganska komplext beteende över olika centrala sjukdomar3. När det gäller primära hjärntumörer (t.ex. glioblastom) flyttas dessa celler mot en antiinflammatorisk fenotyp som stöder tumörceller för att kolonisera hjärnparenkymet3. Många publikationer har förbättrat dessa cellers viktiga roll under tumörprogression. En av de främsta orsakerna till detta är att gliomassocierad mikroglia och infiltrerade makrofager (GAM) står för en tredjedel av den totala tumörmassan, vilket tyder på det entydiga inflytandet av deras aktiveringstillstånd under hjärntumörprogression 4,5.
I den venen har svamp- β-glukaner beskrivits som potenta molekyler som utlöser effektiva immunsvar, inklusive fagocytos och proinflammatorisk faktorproduktion, vilket leder till eliminering av skadliga medel 6,7,8,9,10. Svamp- β-glukaner har generellt studerats med hjälp av extrakt från olika svampdelar. Tilldelningen av specifika effekter kräver emellertid dess rening för att undvika tvetydigheter och för att kunna förstå verkningsmekanismen för sådana molekyler som immunmodulerande medel8.
I detta arbete renas lösliga β-glukaner från fruktkroppen av fyra olika svampar, som regelbundet används som ätliga (Pleurotus ostreatus och Pleurotus djamor) och som medicinska (Ganoderma lucidum och Hericium erinaceus) svampar. I synnerhet har dessa fyra svampar stor användning inom livsmedels- och läkemedelsindustrin och producerades inom en miljövänlig cirkulär ekonomi i ett kommersiellt företag (se materialtabell).
För att lägga grunden för framtida användning av svamp-β-glukaner i hjärncancerterapier är väldefinierade reningsstrategier och prekliniska studier som fördjupar sig i deras förmodade interaktion med immunsystemets celler avgörande för att utvärdera deras potentiella roll som antitumörmediatorer. Detta arbete beskriver de många stegen av isolering och rening som behövs för att hämta de lösliga β-glukanerna som finns i fruktkropparna i den valda svampen. När de väl har renats aktiveras mikrogliaceller för att förbättra deras inflammatoriska fenotyp. Musglioblastomceller (GL261) är belagda med ett annat mikroglia-konditionerat medium, som tidigare behandlats med dessa extrakt, och sedan utvärderas dess effekt på tumörcellernas beteende. Intressant nog har pilotstudier från vårt laboratorium (data visas inte) avslöjat hur proinflammatorisk mikroglia kan bromsa tumörcellmigration och invasionsegenskaper inte bara i glioblastomceller utan också i andra cancercellinjer. Detta tvärvetenskapliga arbete kan ge ett användbart verktyg för onkologiforskare att testa lovande föreningar som kan öka immunsvaret i många olika typer av tumörer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

En av de största utmaningarna med att utveckla effektiva terapier mot glioblastom är att övervinna den starka immunsuppressionen inom tumörmikromiljön. Immunterapi har vuxit fram som en effektiv strategi för att vända immunsystemets svar mot tumörceller. Gliomassocierade makrofager och mikroglia (GAM) är viktiga drivkrafter för sådana antiinflammatoriska scenarier. Därför kan förbättring av det anti-cancerösa svaret i GAM representera en potentiell samadjuvant behandling för behandling av glioblastompatienter. I den venen har svamp- β-glukanmolekyler länge varit kända som potenta immunmodulatorer. Deras förmåga att stimulera den medfödda immunaktiviteten och förbättra behandlingssvaret har beskrivits. Dessa modulerande egenskaper tillskrivs delvis deras förmåga att binda till mönsterigenkänningsreceptorer, som intressant nog uttrycks starkt i GAM. Således är detta arbete inriktat på isolering, rening och efterföljande användning av svamp-β-glukaner för att förbättra tumördödande respons av mikroglia mot glioblastomceller. Musglioblastom (GL261) och mikroglia (BV-2) cellinjer används för att testa de immunmodulerande egenskaperna hos fyra olika svamp- β-glukaner extraherade från svamp som används kraftigt i den nuvarande biofarmaceutiska industrin: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus och Ganoderma lucidum. För att testa dessa föreningar utfördes samstimuleringsanalyser för att mäta effekten av ett föraktiverat mikroglia-konditionerat medium på proliferations- och apoptosaktiveringen i glioblastomceller.

Framgångsrik rening av β-glukaner Massan av MP, SMP och SβG som erhålls från fruktkroppar av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus efter extraktions- och reningsprocessen sammanfattas i tabell 1. Den grundläggande sammansättningen (totala kolhydrater, β-glukaner och protein) av MP, SMP och SβG erhållna från svamparna visas i tabell 2. Dessa resultat visar hur protokollet möjliggjorde hämtning av en stor m...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Detta protokoll beskriver reningsstegen och efterföljande studier av fyra olika svamp-β-glukaner som potentiella immunmodulerande molekyler som förbättrar de antitumörala egenskaperna hos mikroglia mot glioblastomceller.

Isolering och rening av svamp β-glukan som en immunterapistrategi för glioblastom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Svamp beta-glukaner är viktiga modulatorer av immunsystemet. Att förbättra renhets- och isoleringsprotokollen är avgörande för att hävda deras potentiella roll som co-adjuvans för cancerbehandling. En hög grad av fyra olika betaglukaner uppnåddes med hjälp av olika enheter som vanligtvis finns i molekylärbiologiska och proteomiska laboratorier.Detta protokoll fokuserar på att testa effekterna av betaglukaner på mikroglia, hjärnans vanligaste bosatta immuncell. Modulering av mikrogliafenotypen i glioblastom kan ge viktiga insikter om. Börja extraktionen av lösliga svamppolysackarider eller SMP genom att skölja färska fruktkroppar av Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus och Ganoderma lucidum med destillerat vatten fem gånger.Torka sedan de tvättade fruktkropparna helt vid 50 grader Celsius i en konventionell lufttorkugn i cirka 24 timmar innan du maler dem i en bladkvarn och får cirka 200 gram pulver från varje svamp. Därefter suspendera 100 gram av alla fyra svamppulver eller MP i 1 000 ml destillerat vatten och autoklavera suspensionen vid 121 grader Celsius i 15 minuter. Efter 30 minuters inkubation vid rumstemperatur centrifugeras den resulterande suspensionen vid 6 000 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Torka sedan fällningen innehållande olösliga svamppolysackarider eller IMPs vid 50 grader Celsius i en lufttorkugn i 24 timmar. Kassera fällningen och koncentrera supernatanten 10 gånger i en roterande indunstare. Fäll sedan ut koncentratet innehållande SMP med etanol över natten vid fyra grader Celsius.Efter centrifugering av etanolsuspensionen vid 6 000 G i 15 minuter vid fyra grader Celsius, kassera supernatanten med en pipett och tvätta pelleten tre gånger med 80% etanol innan den löses upp och destillerat vatten. Justera pH till 6,5 till 7 och temperaturen till 37 grader Celsius och solubilisera alfaglukanerna genom att behandla suspensionen med två enheter respektive fyra enheter alfa-amylas respektive glukosamylas. Därefter justera pH till 8,0 och temperatur till 50 grader Celsius och solubilisera proteinerna genom att behandla suspensionen med alkalas motsvarande 2,5 enheter per gram protein.Efter hydrolys, centrifugera hydrolysatet och rengör supernatantkoncentratet fem gånger i en roterande indunstare. Fäll ut supernatantkoncentratet igen genom tillsats av 80 % etanol. För att avlägsna molekyler med låg molekylvikt, solubilisera fällningen i destillerat vatten och dialysera den i destillerat vatten i 24 timmar med 12 000 Dalton avskurna cellulosaslangmembran.Återvinn den vattenlösliga delen och frystorka den för att producera lösliga betaglukaner eller S beta-Gs. Utvärdera de totala glukanerna och alfa-glukanerna separat. Mät de resulterande betaglukanvärdena som skillnaden mellan de totala glukan- och alfaglukanvärdena.För att erhålla S beta-G UV-spektra med användning av en UV-synlig spektrofotometer, förbered 1,0 milligram per milliliter av varje S beta-G i destillerat vatten. Överför provet till en kvartskyvett och skanna vid rumstemperatur i 200 till 400 nanometerområdet. Uppskatta homogeniteten hos S beta-Gs och molekylvikten hos polymerer genom storleksuteslutningskromatografi eller SEC med hjälp av ett högpresterande vätskekromatografi- eller HPLC-system utrustat med en UV-synlig detektor och en Superdex TM 200 10/300 GL gelfiltreringskolonn.Spela in provets infraröda spektra på en Fourier-transform infraröd eller FTIR-spektrometer i intervallet 4 000 till 500 per centimeter. Aktivera mikroglia genom att belägga BV2-mikrogliacellerna i 72 timmar med 0,2 milligram per milliliter koncentration av fyra olika betaglukaner isolerade från P.ostreatus, P.djamor, G. lucidum och H.erinaceus. Efter 72 timmar, samla supernatanten med en pipett och passera den återstående volymen genom ett 0,20 mikrometer sprutfilter.Frys sedan supernatanten vid minus 80 grader Celsius i minst 24 timmar. För att behandla GL 261 med det föraktiverade mikrogliakonditionerade mediet, tillsätt 250 mikroliter beta-glukanbehandlat mikroglialmedium till 80% konfluent GL 261-celler i 72 timmar. Kassera mediet efter 72 timmar.UV-spektra för de olika S beta-Gs visade inte UV-absorptionstoppar vid 260 och 280 nanometer, vilket indikerar att S beta-Gs saknade nukleinsyror och proteiner. HPLC-kromatogrammen visade god homogenitet med en huvudskarp och enkel topp vid 10,9 minuter för P.ostreatus, 10,5 minuter för lucidum, 11,3 minuter för P.djamor och 8,20 minuter för H. erinaceus, vilket tyder på att fraktionen överensstämmer med homopolymerer. FTIR-spektra mätte de molekylära vibrationer som motsvarar kovalenta polysackaridbindningar.Det visade sig att SS beta-Gs bestod av kolhydrater konjugerade med ett minimalt protein. HPTLC och GC-MS som analyserade monosackaridprofilen för S beta-Gs avslöjade närvaron av en stor mängd D-glukos, mindre mängder D-galaktos och D-mannos och ett spår av D-xylos, D-rhamnos, D-fukos och L-arabinos. Med hjälp av ett internt skript i ImageJ-programvaran kvantifierades antalet positiva pixlar för varje fluorescerande kanal.Skriptet använde kontrollprover som ett tröskelvärde för intensiteten hos varje fluorofor och gav antalet pixlar. Det indikerade uttrycket för varje markör efter olika experimentella betingelser. Intressant nog drabbades GL 261 inte av signifikanta skillnader när det gäller tumörproliferation vid exponering för de olika mikrogliakonditionerade medierna.P.djamor och H.erinaceus visade dock stark induktion av en ungefär sexfaldig respektive niofaldig ökning av klyvd kaspas-3. Att säkerställa en högkvalitativ renhet av betaglukaner är avgörande för detta protokoll. Detta protokoll använder avancerad utrustning som spektrofotometer, HPLC.eller FITR. Genom att använda dessa verktyg förbättras robustheten i våra resultat. Vi kan med säkerhet analysera effekterna av beta-glukaner på microglia och få mer säkra resultat.På grund av tids- och världsbegränsning har vi begränsat vårt protokoll till studier av betaglukaner på mikrogliaceller. Men andra celler från immunsystemet som makrofager eller T-celler kan lätt lätt under detta protokoll. För första gången kombinerar dessa protokoll två olika kunskapsområden.För det första användningen av biotekniska förfaranden för att rena specifika produkter och för det andra användningen av cellodlingstekniker för att testa deras immunmodulerande egenskaper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lektin-baserade isolering och odling av mus Embryonala Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metod för inspelning Intracellulärt Spännings svar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer och Intern på ljusstimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning som en åtgärd av lärande och minne

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering av Motor Axon navigering och kvantifiering av Axon Arborization i musembryon som använder ljus ark fluorescensmikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rening av dendritiska Filopodia-rik fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypiska kulturer av vuxna mänskliga cortex som en ex vivo-modell för human stamcellstransplantation och validering

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Användning av kycklingembryohjärna som modell för att studera beteende hos mänskliga glioblastomceller

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Författare i fokus: Användning av kycklingembryohjärnan som modell för in vivo- och ex vivo-analyser av mänskligt glioblastomcellsbeteende  

Använda kycklingembryohjärnan som modell för in vivo- och ex vivo-analyser av humant glioblastomcellbeteende

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...