Name: isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Dr. Vasiliki Economopoulos'a ImageJ'deki fuluorescence sinyalini ölçmek için hazırladığı kurum içi senaryosu için teşekkür ederiz. Ayrıca CITIUS'a (Sevilla Üniversitesi) ve tüm personeline gösteri sırasındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma İspanyol FEDER I + D + i-USE, Sevilla Üniversitesi'nden US-1264152 ve Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 tarafından desteklenmiştir

Bu protokolde açıklanan dört farklı mantar çeşidi ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Mantar β-glukanların izolasyonu
<ol><li>Çözünür mantar polisakkaritlerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu NOT: Çözünür mantar polisakkaritleri (SMP'ler) Şekil 1'de şematik olarak gösterilen prosedüre göre elde edilmiştir.<ol><li>Taze P. ostreatus, P. djamor, H. erinac...

<ol>
	<li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+curing+primary+brain+tumours.">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li><li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+in+glioblastoma:+current+understanding+and+therapeutic+implications.">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).</li><li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages/microglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment.">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).</li><li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+&amp;#34;cold&amp;#34;+into+&amp;#34;hot&amp;#34;+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers.">Turning &amp;#34;cold&amp;#34; into &amp;#34;hot&amp;#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).</li><li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis.">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).</li><li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses.">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li><li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medicinal+fungi-derived+&#946;-glucan+on+tumor+progression.">Effects of medicinal fungi-derived &#946;-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).</li><li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells.">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 2, 25 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune.">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li><li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction.">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li><li>Chrom&#253;, V., Vinkl&#225;rkov&#225;, B., &#352;prongl, L., Bittov&#225;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine.">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li><li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lowry+method+for+protein+quantitation.">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms.">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2.">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173 (2020).</li><li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy.">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).</li><li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro.">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li><li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+mushrooms+and+beta-glucans:+impact+on+human+health.">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).</li><li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants.">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li><li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies:+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification.">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li><li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus.">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).</li><li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer:+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12,155+patients.">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li><li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa.">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li><li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180.">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li><li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent.">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li></ol>

Bu çalışma, SβG'lerin içeriğini dört farklı mantardan başarılı bir şekilde izole etmek, saflaştırmak ve karakterize etmek için köklü tekniklerin kullanımını açıklamaktadır. Sonuçlar, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'tan elde edilen SMP'lerin sıcak su ekstraksiyonundan ve ardından α-amilaz, glukozidaz ve proteaz ile hidrolitik işlemden sonra, α-glukan ve protein içeriğinin nasıl azaldığını ve böylece saf SβG'lerin miktarını önemli ölç...

Nöro-onkoloji alanında yeni başarıların ortaya çıkmasına rağmen, glioblastoma hastalarının yaşam beklentisi yetersiz kalmaktadır. Beyin tümörlerine karşı altın standart tedaviler cerrahi, radyoterapi ve kemoterapinin birleştirilmesine dayanır. Bununla birlikte, son on yılda, immünoterapi, farklı kanser türlerini tedavi etmek için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır1. Bu nedenle, vücudun tümör hücrelerine karşı bağışıklık tepkisini kullanma olasılığı son zamanlarda onkolojinin dördüncü ayağı haline gelmiştir.
Alandaki en büyük zorluklardan birinin, tümör mikroçevre2'de bulunan güçlü immünsüpresyonun üstesinden gelmek olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Özellikle, beyin kanserinin en yaygın ve agresif formlarından biri olan glioblastoma durumunda, bu tür pro-tümöral senaryoları düzenleyen kilit yolları çözmek ve bağışıklık sisteminin iç karartıcı tepkisine karşı koyabilecek yeni bileşikler bulmak, bu tedavi edilemez hastalığa karşı gelecekteki tedavilerin yolunu açabilir.
Beyin kendi bağışıklık sistemi hücrelerine sahiptir ve en alakalı hücre tipi mikrogliadır. Bu hücrelerin farklı merkezi hastalıklarda oldukça karmaşık bir davranışa sahip oldukları kanıtlanmıştır3. Primer beyin tümörleri (örneğin, glioblastoma) durumunda, bu hücreler beyin parankimini kolonize etmek için tümör hücrelerini destekleyen bir anti-enflamatuar fenotipe doğru kaydırılır3. Çok sayıda yayın, tümör progresyonu sırasında bu hücrelerin ana rolünü arttırmıştır. Bunun başlıca nedenlerinden biri, glioma ile ilişkili mikroglia ve infiltrasyon makrofajlarının (GAM'lar) toplam tümör kütlesinin üçte birini oluşturmasıdır, bu nedenle beyin tümörü ilerlemesi sırasında aktivasyon durumlarının kesin etkisini düşündürmektedir 4,5.
Bu bağlamda, mantar β-glukanlar, fagositoz ve pro-inflamatuar faktörlerin üretimi de dahil olmak üzere etkili immün yanıtları tetikleyen ve zararlı ajanların eliminasyonuna yol açan güçlü moleküller olarak tanımlanmıştır 6,7,8,9,10. Mantar β-glukanlar genellikle farklı mantar parçalarından elde edilen ekstraktlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, spesifik etkilerin atfedilmesi, belirsizliklerden kaçınmak ve immünomodülatör ajanlar gibi moleküllerin etki mekanizmasını anlayabilmek için saflaştırılmasını gerektirir8.
Bu çalışmada, çözünür β-glukanlar, düzenli olarak yenilebilir (Pleurotus ostreatus ve Pleurotus djamor) ve tıbbi (Ganoderma lucidum ve Hericium erinaceus) mantarlar olarak kullanılan dört farklı mantarın meyve veren gövdesinden saflaştırılır. Özellikle, bu dört mantar gıda ve ilaç endüstrisinde büyük kullanıma sahiptir ve ticari bir işletmede çevre dostu bir döngüsel ekonomi içinde üretilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
Beyin kanseri tedavilerinde mantar β-glukanların gelecekteki kullanımının temelini atmak için, iyi tanımlanmış saflaştırma stratejileri ve bağışıklık sistemi hücreleri ile varsayılan etkileşimlerini araştıran klinik öncesi çalışmalar, anti-tümör aracıları olarak potansiyel rollerini değerlendirmek için gereklidir. Bu çalışma, seçilen mantarın meyve veren gövdelerinde bulunan çözünür β-glukanları elde etmek için gereken sayısız izolasyon ve saflaştırma adımını açıklamaktadır. Başarılı bir şekilde saflaştırıldıktan sonra, mikroglia hücreleri enflamatuar fenotiplerini arttırmak için aktive edilir. Fare glioblastoma hücreleri (GL261), daha önce bu ekstraktlarla muamele edilen farklı bir mikroglia şartlandırılmış ortam ile kaplanır ve daha sonra tümör hücrelerinin davranışları üzerindeki etkisi değerlendirilir. İlginç bir şekilde, laboratuvarımızdan yapılan pilot çalışmalar (veriler gösterilmemiştir), pro-inflamatuar mikroglia'nın sadece glioblastoma hücrelerinde değil, diğer kanser hücre hatlarında da tümör hücresi göçünü ve istila özelliklerini nasıl yavaşlatabileceğini ortaya çıkarmıştır. Bu multidisipliner çalışma, onkoloji araştırmacılarının birçok farklı tümör türünde bağışıklık tepkisini artırabilen umut verici bileşikleri test etmeleri için yararlı bir araç sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>171080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-drying oven</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td>2000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcalase</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td>protease</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>A32728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade mill</td>
			<td>Retsch, Germany</td>
			<td>&#160;SM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose tubing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>D9402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colocalisation pluggins</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&#160;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans</td>
			<td>Pharmacosmos, Holbalk, Denmark</td>
			<td>Dextran 410, 80, 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s modified Eagle&#180;s medium, Gluta MAXTM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>10564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extenda (&#945;- Amylase/Glucoamylase)</td>
			<td>Novozymes, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A4736301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectromete</td>
			<td>Bruker-Vertex, Switzerland</td>
			<td>VERTEX 70v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing and analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>Waters 2695 HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppedorf</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td>
			<td>725500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MERK, Germany</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Crison, Barcelona, Spain</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>1010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab243998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Ki-67 Monoclonal</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi Ib&#233;rica S.L.U., Spain</td>
			<td>El Rotavapor R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)</td>
			<td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT011545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Amersham Bioscience, UK</td>
			<td>Ultrospec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Laboratories, C.A, USA</td>
			<td>H-5000-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>J.P. Selecta S.A., Spain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucan Assay Kit</td>
			<td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td>
			<td>K-BGLU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glucans</td>
			<td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td>
			<td></td>
			<td>Supplied the four variants of mushrooms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of fungal &#946;-glucan as an immunotherapy strategy for glioblastoma

Glioblastoma karşı etkili tedaviler geliştirmedeki en büyük zorluklardan biri, tümör mikro ortamındaki güçlü bağışıklık baskılanmasının üstesinden gelmektir. İmmünoterapi, bağışıklık sistemi tepkisini tümör hücrelerine karşı çevirmek için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Glioma ile ilişkili makrofajlar ve mikroglia (GAM'lar) bu tür anti-enflamatuar senaryoların ana itici güçleridir. Bu nedenle, GAM'larda anti-kanseröz yanıtın arttırılması, glioblastoma hastalarını tedavi etmek için potansiyel bir ko-adjuvan tedaviyi temsil edebilir. Bu damarda, mantar β-glukan molekülleri uzun zamandır güçlü bağışıklık modülatörleri olarak bilinmektedir. Doğuştan gelen bağışıklık aktivitesini uyarma ve tedavi yanıtını iyileştirme yetenekleri tanımlanmıştır. Bu modüle edici özellikler kısmen, ilginç bir şekilde, GAM'larda büyük ölçüde ifade edilen örüntü tanıma reseptörlerine bağlanma yeteneklerine atfedilir. Bu nedenle, bu çalışma, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın tümör öldürücü tepkisini arttırmak için mantar β-glukanların izolasyonu, saflaştırılması ve daha sonra kullanılmasına odaklanmıştır. Fare glioblastomu (GL261) ve mikroglia (BV-2) hücre hatları, mevcut biyofarmasötik endüstrisinde yoğun olarak kullanılan mantarlardan ekstrakte edilen dört farklı mantar β-glukanının immünomodülatör özelliklerini test etmek için kullanılır: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum. Bu bileşikleri test etmek için, önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış bir ortamın glioblastoma hücrelerinde proliferasyon ve apoptoz aktivasyonu üzerindeki etkisini ölçmek için ko-stimülasyon testleri yapıldı.

β-glukanların başarılı bir şekilde saflaştırılması Ekstraksiyon ve saflaştırma işlemini takiben P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'un meyve veren cisimciklerinden elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin kütlesi Tablo 1'de özetlenmiştir. Mantarlardan elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin temel bileşimi (toplam karbonhidratlar, β-glukanlar ve protein) Tablo 2'de gösterilmiştir. Bu sonuçlar, protokolün SMP'...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Fungal Î²-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma at JoVE.com

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Bu protokol, dört farklı mantar β-glukanının saflaştırma adımlarını ve sonraki çalışmalarını, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın anti-tümöral özelliklerini geliştiren potansiyel immünomodülatör moleküller olarak tanımlamaktadır.

Glioblastoma için İmmünoterapi Stratejisi Olarak Fungal β-Glukan'ın İzolasyonu ve Saflaştırılması

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Fungal beta-glukanlar bağışıklık sisteminin önemli modülatörleridir. Saflık ve izolasyon protokollerinin arttırılması, kanser tedavisi için ortak adjuvan olarak potansiyel rollerini ortaya koymak için gereklidir. Moleküler biyoloji ve proteomik laboratuvarlarda yaygın olarak bulunan çeşitli cihazlar kullanılarak dört farklı beta-glukandan oluşan yüksek bir dereceye ulaşıldı.Bu protokol, beta-glukanların beynin en bol bulunan yerleşik bağışıklık hücresi olan mikroglia üzerindeki etkilerini test etmeye odaklanmaktadır. Glioblastomada mikroglia fenotipini modüle etmek, önemli bilgiler sağlayabilir. Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum'un taze meyve veren gövdelerini damıtılmış suyla beş kez durulayarak çözünür mantar polisakkaritlerinin veya SMP'lerin ekstraksiyonuna başlayın.Daha sonra, yıkanmış meyve veren gövdeleri, her mantardan yaklaşık 200 gram toz elde eden bir bıçak değirmeninde öğütmeden önce yaklaşık 24 saat boyunca geleneksel bir hava kurutma fırınında 50 santigrat derecede tamamen kurutun. Daha sonra, dört mantar tozunun veya MP'nin 100 gramını 1.000 mililitre damıtılmış suda askıya alın ve süspansiyonu 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık inkübasyondan sonra, elde edilen süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin.Daha sonra çözünmeyen mantar polisakkaritleri veya IMP'leri içeren çökeltiyi 50 santigrat derecede 24 saat boyunca hava kurutma fırınında kurutun. Çökeltiyi atın ve süpernatantı döner bir evaporatörde 10 kez konsantre edin. Daha sonra, SMP'leri içeren konsantreyi gece boyunca dört santigrat derecede etanol ile çökeltin.Etanol süspansiyonunu 6.000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı bir pipetle atın ve peleti çözmeden ve damıtılmış suyla çözmeden önce% 80 etanol ile üç kez yıkayın. PH'ı 6.5 ila 7'ye ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın ve süspansiyonu sırasıyla iki birim ve dört birim alfa-amilaz ve glukoamilaz ile muamele ederek alfa-glukanları çözündürün. Daha sonra, pH'ı 8.0'a ve sıcaklığı 50 santigrat dereceye ayarlayın ve süspansiyonu gram protein başına 2.5 birime eşdeğer alkalaz ile muamele ederek proteinleri çözünürleştirin.Hidrolizden sonra, hidrolizatı santrifüj edin ve süpernatant konsantresini döner bir evaporatörde beş kez temizleyin. %80 etanol ekleyerek süpernatant konsantresini tekrar çökeltin. Düşük molekül ağırlıklı molekülleri uzaklaştırmak için, çökeltiyi damıtılmış suda çözündürün ve 12.000 Dalton kesme selüloz boru membranı kullanarak 24 saat boyunca damıtılmış suda diyaliz edin.Suda çözünür kısmı geri kazanın ve çözünür beta-glukanlar veya S beta-Gs üretmek için dondurarak kurutun. Toplam glukanları ve alfa-glukanları ayrı ayrı değerlendirin. Elde edilen beta-glukan değerlerini, toplam glukan ve alfa-glukan değerleri arasındaki fark olarak ölçün.Bir UV görünür spektrofotometre kullanarak S beta-G UV spektrumlarını elde etmek için, damıtılmış suda her bir S beta-G'nin mililitresi başına 1.0 miligram hazırlayın. Numuneyi bir kuvars küvete aktarın ve 200 ila 400 nanometre bölgesinde oda sıcaklığında tarayın. UV görünür dedektörü ve Superdex TM 200 10/300 GL jel filtrasyon sütunu ile donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi veya HPLC sistemi kullanarak S beta-G'lerin homojenliğini ve polimerlerin moleküler ağırlığını boyut dışlama kromatografisi veya SEC ile tahmin edin.Numunenin kızılötesi spektrumlarını, santimetre başına 4.000 ila 500 aralığında bir Fourier dönüşümlü kızılötesi veya FTIR spektrometresine kaydedin. BV2 mikroglia hücrelerini 72 saat boyunca P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum ve H.erinaceus'tan izole edilen dört farklı beta-glukan konsantrasyonu mililitre konsantrasyonu başına 0.2 miligram ile kaplayarak mikrogliayı aktive edin. 72 saat sonra, süpernatantı bir pipetle toplayın ve kalan hacmi 0.20 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin.Daha sonra süpernatantı eksi 80 santigrat derecede en az 24 saat dondurun. GL 261'i önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış ortam ile tedavi etmek için, 72 saat boyunca% 80 confluent GL 261 hücrelerine 250 mikrolitre beta-glukan ile muamele edilmiş mikroglial ortam ekleyin. Ortamı 72 saat sonra atın.Farklı S beta-G'lerin UV spektrumları, 260 ve 280 nanometrelerde UV absorpsiyon zirveleri göstermedi, bu da S beta-Gs'nin nükleik asitlerden ve proteinlerden yoksun olduğunu gösterdi. HPLC kromatogramları, P.ostreatus için 10.9 dakika, lucidum için 10.5 dakika, P.djamor için 11.3 dakika ve H.erinaceus için 8.20 dakika olmak üzere ana keskin ve tek bir tepe noktası ile iyi bir homojenlik gösterdi ve bu da fraksiyonun homopolimerlerle tutarlı olduğunu düşündürdü. FTIR spektrumları, kovalent polisakkarit bağlarına karşılık gelen moleküler titreşimleri ölçtü.SS beta-Gs'nin minimal bir protein ile konjuge edilmiş karbonhidratlardan oluştuğunu gösterdi. S beta-Gs'nin monosakkarit profilini analiz eden HPTLC ve GC-MS, BÜYÜK MIKTARDA D-glikoz, daha az miktarda D-galaktoz ve D-mannoz ve D-ksiloz, D-ramnoz, D-fukoz ve L-arabinoz izlerinin varlığını ortaya koydu. ImageJ yazılımında şirket içi bir komut dosyası kullanılarak, her floresan kanal için pozitif piksel sayısı ölçüldü.Komut dosyası, kontrol örneklerini her floroforun yoğunluğu için bir eşik olarak kullandı ve piksel sayısını sağladı. Farklı deneysel koşullardan sonra her bir belirteç için ifadeyi gösterdi. İlginçtir ki, GL 261, farklı mikroglia şartlandırılmış ortamlara maruz kalmada tümör proliferasyonu ile ilgili önemli farklılıklar yaşamamıştır.Bununla birlikte, P.djamor ve H.erinaceus, yarıklı kaspaz-3'te sırasıyla yaklaşık altı kat ve dokuz kat artışın güçlü bir indüksiyonunu göstermiştir. Beta-glukanların yüksek dereceli saflığının sağlanması bu protokol için esastır. Bu protokol spektrofotometre, HPLC gibi gelişmiş ekipmanları kullanır.veya FITR. Bu araçları kullanmak, bulgularımızın sağlamlığını artırır. Beta-glukanların mikroglia üzerindeki etkilerini güvenle analiz edebilir ve daha güvenli sonuçlar elde edebiliriz.Zaman ve dünya sınırlaması nedeniyle, protokolümüzü mikroglial hücreler üzerindeki beta-glukanların incelenmesiyle sınırlandırdık. Bununla birlikte, makrofajlar veya T hücreleri gibi bağışıklık sisteminden diğer hücreler bu protokol sırasında kolayca olabilir. İlk kez, bu protokoller iki farklı bilgi alanını birleştiriyor.Birincisi, belirli ürünleri saflaştırmak için biyoteknolojik prosedürün kullanılması ve ikincisi, immünomodülatör özelliklerini test etmek için hücre kültürü tekniklerinin kullanılması.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Nörobilim

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Öğrenme ve Bellek Tedrisi Olan Drosophila Kurbanlığı İklimlendirme

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra Balığı Kullanarak Öğrenme ve Bellek Çalışmalarında Bilişsel Değerlendirme için İlişkisel Bir Öğrenme Aracı Olarak Mekik Kutusu Tahlil

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...