Name: a protocol to evaluate and quantify retinal pigmented epithelium pathologies in mouse models of age-related macular degeneration
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Satoshi Kinoshita und dem Translational Research Initiatives in Pathology Laboratory (TRIP) der University of Wisconsin (UW) für die Vorbereitung unseres Gewebes auf die Lichtmikroskopie. Dieser Kern wird von der Abteilung für Pathologie und Labormedizin der UW, dem Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (P30 CA014520) und dem Büro des Direktors-NIH (S10OD023526) unterstützt. Die konfokale Mikroskopie wurde am UW Biochemistry Optical Core durchgeführt, der mit Unterstützung des UW Department of Biochemistry Endowment eingerichtet wurde. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse des National Eye Institute (R01EY022086 an A. Ikeda; R01EY031748 an C. Bowes Rickman; P30EY016665 an die Abteilung für Augenheilkunde und Sehwissenschaften der UW; P30EY005722 zum Duke Eye Center; NIH T32EY027721 an M. Landowski; F32EY032766 an M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); und ein uneingeschränkter Zuschuss von der Forschung zur Verhinderung von Blindheit (Duke Eye Center).

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie
<ol><li>Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Parafor...

<ol>
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In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Unters...

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft1. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD2 ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten3. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle4,5 und Mäuse 6,7,8. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurden standardisierte Protokolle und Qualitätskontrollkriterien für RPE-Zellkulturmodellebeschrieben 4, jedoch wurde in keinem Bericht versucht, die Phänotypisierung des RPE in Mausmodellen zu standardisieren. Tatsächlich fehlt in vielen Veröffentlichungen zu Mausmodellen der AMD eine vollständige Beschreibung des RPE oder eine Quantifizierung der RPE-Pathologien in ihnen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Standard-RPE-Phänotypisierungsmethoden mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler mit AMD-Mausmodellen zu präsentieren.
Frühere Veröffentlichungen haben das Vorhandensein mehrerer RPE-Pathologien bei Mäusen durch drei bildgebende Verfahren festgestellt. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es Forschern beispielsweise, die grobe Morphologie der murinen Netzhaut zu betrachten (Abbildung 1A) und RPE-Pathologien wie RPE-Verdünnung, Vakuolisierung und Migration zu erkennen. Die RPE-Ausdünnung in einem AMD-Mausmodell wird durch eine Abweichung der RPE-Höhe von den jeweiligen Kontrollen veranschaulicht (Abbildung 1B). Die RPE-Vakuolisierung kann in zwei separate Kategorien unterteilt werden: Mikrovakuolisierung (Abbildung 1C) und Makrovakuolisierung (Abbildung 1D). Die RPE-Mikrovakuolisierung wird durch das Vorhandensein von Vakuolen im RPE zusammengefasst, die seine Gesamthöhe nicht beeinflussen, während die Makrovakuolisierung durch das Vorhandensein von Vakuolen angezeigt wird, die in die äußeren Segmente der Photorezeptoren hineinragen. Die RPE-Migration wird durch das fokale Pigmentaggregat oberhalb der RPE-Monoschicht in einem Netzhautquerschnitt unterschieden (Abbildung 1E). Es sollte beachtet werden, dass migrierende RPE-Zellen in AMD-Spenderaugen Immunreaktivität gegenüber Immunzellmarkern wie dem Cluster of Differentiation 68 (CD68)9 aufweisen und Immunzellen darstellen könnten, die RPE-Trümmer verschlingen, oder RPE, die sich einerTransdifferenzierung unterziehen9. Ein weiteres bildgebendes Verfahren, die sogenannte Transmissionselektronenmikroskopie, kann es den Forschern ermöglichen, die Ultrastruktur des RPE und seiner Basalmembran sichtbar zu machen (Abbildung 2A). Mit dieser Technik kann die vorherrschende Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen identifiziert werden, die als basale laminare Ablagerung (BLamD) bekannt ist (Abbildung 2B)10. Schließlich kann die konfokale Mikroskopie die Struktur von RPE-Zellen durch die Abbildung von RPE-Flachhalterungen aufdecken (Abbildung 3A). Mit dieser Methode kann die RPE-Dysmorphie, die Abweichung des RPE von seiner klassischen Wabenform (Abbildung 3B), aufgedeckt werden. Es kann auch die RPE-Mehrkernbildung erkennen, d. h. das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen innerhalb einer RPE-Zelle (Abbildung 3C). Für eine Zusammenfassung der Arten von RPE-Pathologien, die in aktuellen AMD-Mausmodellen vorhanden sind, verweisen wir Forscher auf diese Übersichtsarbeiten aus der Literatur 6,7.
Forscher, die AMD untersuchen, sollten sich der Vor- und Nachteile der Verwendung von Mäusen zur Untersuchung von RPE-Pathologien vor dem Phänotypisierungsprotokoll bewusst sein. Mäuse zeichnen sich durch ihre relativ kurze Lebensdauer und Kosteneffizienz sowie ihre genetische und pharmakologische Manipulierbarkeit aus. Mäuse weisen auch degenerative RPE-Veränderungen auf, einschließlich RPE-Migration, Dysmorphie und Mehrkernbildung, die in AMD-Spenderaugen beobachtet werden 11,12,13,14,15,16,17; Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Mechanismen der Entwicklung dieser RPE-Pathologien bei Mäusen und Menschen zugrunde liegen könnten. Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Mausstudien auf die menschliche AMD einschränken. Erstens haben Mäuse keine Makula, eine anatomisch unterschiedliche Region der menschlichen Netzhaut, die für die Sehschärfe notwendig ist und bei AMD bevorzugt betroffen ist. Zweitens werden einige RPE-Pathologien bei Mäusen, wie z. B. RPE-Verdünnung und Vakuolisierung, typischerweise nicht in AMD-Spenderaugen beobachtet18. Drittens entwickeln Mäuse keine Drusen, ein Kennzeichen der AMD-Pathologie19. Drusen sind lipid- und proteinhaltige Ablagerungen mit sehr wenigen Basalmembranproteinen, die sich zwischen der RPE-Basallamina und der inneren kollagenen Schicht der Bruchschen Membran (BrM) bilden19. Drusen unterscheiden sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer anatomischen Lage von BLamD, der häufigen Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen. BLamDs sind alters- und stressabhängige extrazelluläre Matrix-angereicherte Anomalien, die sich zwischen der RPE-Basallamina von BrM und den basalen Infoldings des RPE20 bilden. Interessanterweise haben BLamDs sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen eine ähnliche Proteinzusammensetzung und ein ähnliches Aussehen 6,10,21. Neuere Arbeiten deuten darauf hin, dass BLamDs in der Pathobiologie der AMD eine Rolle spielen können, indem sie das Fortschreiten der AMD in ihre späteren Stadien beeinflussen18,22; Daher können diese Ablagerungen erkranktes RPE in der Netzhaut der Maus darstellen. Das Wissen um diese Vorteile und Einschränkungen ist für Forscher, die daran interessiert sind, Ergebnisse aus Mausstudien auf AMD zu übertragen, von entscheidender Bedeutung.
In diesem Protokoll diskutieren wir die Methoden zur Vorbereitung der Augen auf Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von RPE-Pathologien. Wir beschreiben auch, wie RPE-Pathologien für statistische Tests unvoreingenommen quantifiziert werden können. Als Proof-of-Concept verwenden wir das RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die strukturellen RPE-Pathologien zu untersuchen, die in transmembranprotein 135- (Tmem135) überexprimierenden Mäusen und gealterten Wildtyp (WT) C57BL/6J Mäusen beobachtet wurden. Zusammenfassend ist es unser Ziel, die Phänotypisierungsmethodik zur Charakterisierung des RPE in AMD-Mausmodellen zu beschreiben, da derzeit keine Standardprotokolle verfügbar sind. Forscher, die daran interessiert sind, Pathologien der Photorezeptoren oder der Aderhaut zu untersuchen und zu quantifizieren, die auch in AMD-Mausmodellen betroffen sind, finden dieses Protokoll möglicherweise nicht nützlich für ihre Studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2</td>
			<td>PolyScientiifc R&#38;D Company</td>
			<td>S1619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Capacity Slide Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Two are needed for this protocol (one for H&#38;E-stained slides and one for RPE flat mounts.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol&#160;</td>
			<td>MDS Warehouse</td>
			<td>2292-CASE</td>
			<td>Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>11069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Premade 1x PBS can be used in this protocol.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-283-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 inch PVC Tubing with Luer Ends</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1376778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>T400-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>MDS Warehouse</td>
			<td>2293-CASE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable 237 ml&#160; Spray Bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z192546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4&#34; Length, 1 mm Tip Width</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td>Known as curved forceps in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65575-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Euthanasia Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Flow Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castaloy Prong Extension Clamps</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cast-Iron L-shaped Base Support Stand</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-474-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Prolifer Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available to download: https://cellprofiler.org/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost Microscope Slides Lavender</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled H20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4984</td>
			<td>Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Grid Holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71147-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPON 815 Resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22050460</td>
			<td>Please follow manufacturer&#39;s protocol when using this tissue marking dye.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Mounting Media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-110-610</td>
			<td>Use for mounting H&#38;E slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td>Light source for dissecting microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available to download: https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexaframe Castaloy Hook Connector</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>14-666-18Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16537-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Benchtop Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Cryo Tag Labels</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77564-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM UC7Ultramicrotome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Reichert Ultracut S Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifterSlips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22X22I24788001LS</td>
			<td>Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td>Known as micro-dissecting scissors in protocol.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5&#34; Overall Length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td>Known as curved scissors in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube racks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1RS Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21909-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>21909-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>20412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow Tray for Mouse Perfusions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Eosin Y Alcoholic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>642736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Rack for Staining</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squared Cover Glass Slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish with Cover</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF30</td>
			<td>Need 15 for H&#38;E staining procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>S7510-50</td>
			<td>Use only the syringe barrel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1464917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Use for mounting RPE flat mounts.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22050283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65575-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol to evaluate and quantify retinal pigmented epithelium pathologies in mouse models of age-related macular degeneration

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.

Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse...

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A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Dieses Protokoll ist das erste, das beschreibt, wie die Mausgröße für RP-Pathologien mit Hilfe von Lichttransmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie verarbeitet und bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Einbeziehung quantitativer Beurteilungen der RP-Pathologien, wobei diese drei bildgebenden Verfahren für statistische Vergleiche verwendet werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken können auch dazu beitragen, unser Wissen über molekulare Signalwege zu erweitern, die für die Gesundheit von RPE wichtig sind.Personen, die die Mausgröße noch nicht seziert haben, können mit diesem Protokoll Schwierigkeiten haben. Wir empfehlen diesen Personen, mit einigen Mäusen zu üben, um die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken zu beherrschen. Bereiten Sie zunächst ein Schwerkraft-Perfusionssystem auf einer saugfähigen Unterlage für die Herzperfusion in einem Abzug vor.Gießen Sie 40 Milliliter frisch zubereiteten Fixierpuffer in den Spritzenzylinder des Perfusionssystems. Drehen Sie das Ventil parallel zur Schlauchleitung, damit der Puffer durch die Schlauchleitung fließen kann. Spülen Sie die Leitung, bis alle Luftblasen aus der Leitung entfernt sind.Drehen Sie dann das Ventil senkrecht zur Schlauchleitung, um zu verhindern, dass der Puffer in die Schlauchleitung fließt. Um eine Herzdurchblutung durchzuführen, legen Sie die euthanasierte Maus in eine flache Schale in der Nähe des Perfusionssystems. Mit dem Bauch nach oben.Besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol und machen Sie dann mit einer gebogenen Schere und Pinzette einen fünf Zentimeter tieferen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke auf der linken Seite der Maus unterhalb des Brustkorbs. Fahren Sie mit einem drei Zentimeter langen medialen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke am oberen Ende des unteren Schnitts fort. Machen Sie einen weiteren fünf Zentimeter unteren Schnitt am Ende des medialen Schnitts durch die Haut und die Bauchdecke auf der äußersten rechten Seite der Maus unterhalb des Brustkorbs.Machen Sie einen weiteren drei Zentimeter langen medialen Schnitt, um den Bauchhautlappen mit einer gebogenen Pinzette zu entfernen. Als nächstes schneidest du durch das Zwerchfell und das Brustbein, um das Herz freizulegen. Führen Sie die Messnadel in die linke Herzkammer ein und drehen Sie die Klappe.Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer gebogenen Schere durch, damit Blut und Fixiermittel aus dem Herzen austreten können. Lassen Sie 10 Milliliter Fixierpuffer die Maus ein bis zwei Minuten lang durchbluten oder bis die Leber blass wird und kein Blut mehr aus dem rechten Vorhof fließt. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, drehen Sie das Ventil senkrecht zur Schlauchleitung, um den Pufferfluss zu stoppen.Um die Augen zu entkernen, nehmen Sie die Maus aus der flachen Schale und legen Sie sie auf die saugfähige Unterlage in einem Abzug. Richten Sie dann den Kopf der Maus so aus, dass das linke Auge dem Experimentator zugewandt ist und das rechte Auge außer Sichtweite ist. Markieren Sie die obere Seite des Auges mit einem Gewebemarkierungsfarbstoff.Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger sanft um die Augenhöhle herum, um den Vorsprung des Auges aus der Augenhöhle zu erreichen. Halten Sie dann mit einer gebogenen Schere das Auge mit der Klinge in einem 30-Grad-Winkel von der Augenhöhle und schneiden Sie um das Auge herum. Entfernen Sie den Augapfel mit einer gebogenen Pinzette vom Kopf und legen Sie ihn auf eine saugfähige Unterlage.Schneiden Sie die Hornhaut mit einer Skalpellklinge Nummer 11 ein und legen Sie das Auge mit einer gebogenen Pinzette in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen, das zwei Milliliter Fixierpuffer enthält. Nachdem Sie beide Augen entkernt haben, inkubieren Sie sie über Nacht in einem Fixierpuffer auf einem Shaker in einem Vier-Grad-Raum mit einer Drehzahl von 75 U / min. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Fixierpuffer durch zwei Milliliter PBS und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur und 75 U/min.Als nächstes wird das Auge unter einem Präpariermikroskop in eine mit PBS gefüllte Petrischale gelegt, um hintere Segmente zu erzeugen. Heben Sie Fett und Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom Augapfel ab. Schneiden Sie das Fett und die Muskeln vorsichtig mit einer Mikropräparierschere in paralleler Richtung zum Augapfel ab, bis der Augapfel eine gleichmäßige bläulich-schwarze Farbe hat. Setzen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze an der Hornhautpunktionsstelle an und schneiden Sie mit einer Mikropräparierschere um den Umfang der Hornhaut herum, beginnend an der Punktionsstelle, um die Hornhaut und die Iris aus dem Augapfel zu entfernen.Entfernen Sie dann mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die Linse aus dem Augapfel, um den hinteren Augenabschnitt freizulegen. Legen Sie das hintere Segment in ein Röhrchen mit zwei Millilitern PBS und lagern Sie es bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Übertragen Sie das Auge in eine Petrischale, die PBS enthält, und entfernen Sie die Hornhaut und die Iris wie gezeigt.Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette mit feiner Spitze heraus. Trennen Sie dann mit zwei Pinzetten mit feiner Spitze vorsichtig die Neuralnetzhaut vom hinteren Segment. Schneiden Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut am Sehnervenkopf durch, um sie aus der hinteren Augenmuschel zu entfernen.Legen Sie die Augenmuschel in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen, das fünf Mikroliter PBS enthält. Um die hinteren Augenmuscheln zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter Methanol in das Gewebe und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf einem Shaker bei 75 U/min. Wiederholen Sie die Methanolfixierung dreimal mit abschließender Inkubation für zwei Stunden.Waschen Sie das Gewebe nach der Fixierung dreimal mit PBS, bevor Sie mit der Immunfluoreszenzfärbung und der Visualisierung durch konfokale Mikroskopie fortfahren. Vier Monate alte TMEM 135 TG-Mäuse zeigten eine signifikante Verringerung der Dicke des pigmentierten Epithels oder RPE der Netzhaut in 600 und 900 Mikrometern Entfernung vom Sehnerv im Vergleich zu altersgleichen Wildtyp-Mäusen. Es wurden Fälle von RPE-Pathologien wie Mikrovaskuolisierung, Makrovakuolisierung und Migration von 325 Tage alten WT- und TMEM-135-TG-Mäusen berechnet.Die durchschnittliche Häufigkeit der RPE-Mikrovakuolisierung war im Wildtyp niedriger als bei den TMEM 135 TG Mäusen. Im Wildtyp wurden keine RPE-Makrovakuolisierung und -Migration nachgewiesen, verglichen mit den Durchschnittswerten, die in TMEM 135 TG-Mäusen beobachtet wurden. In der Transmissionselektronenmikroskopie wurden basale laminare Ablagerungen in 24 Monate alten Netzhäuten beobachtet, die in zwei Monate alten Netzhäuten fehlten.Die Analyse der kumulativen Häufigkeiten der basalen laminaren Ablagerungshöhen ergab eine Verschiebung nach rechts der Linie für die 24 Monate alten Mäuse im Vergleich zu den zwei Monate alten Mäusen, was eine Zunahme der Ablagerungen bei 24 Monate alten Mäusen zeigt. Diese Beobachtung wurde durch größere durchschnittliche Körpergrößen in 24 Monate alten Netzhäuten gestützt. RPE in vier Monate alten TMEM 135 TG Mäusen war dysmorph.Das RPE in TMEM 135 TG-Netzhäuten ist größer und weniger dicht als bei altersangepassten Wildtyp-Netzhäuten. Außerdem wurden im Vergleich zu Kontrollen mehr mehrkernige RPE-Zellen in der TG-Netzhaut beobachtet. Diesem Protokoll folgend, konnten die Forscher spezifische Signalwege mit molekularbiologischen Techniken in Mäusen untersuchen, was zu unserem Verständnis beitragen könnte, wie sich diese RP-Pathologien in Mäusen entwickeln.Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die RP-Phänotypisierung bei Mäusen zu standardisieren, was die Erkenntnisse aus Mausstudien auf andere AMD-Modelle übertragen und unser Verständnis der AMD-Pathobiologie verbessern wird.

Research

JoVE Journal

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

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Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Gleichzeitige Video-EEG-EKG Monitoring Neurocardiac Dysfunktion in Mausmodellen der Epilepsie zu identifizieren

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Eine anpassbare Protokoll für String Montage gRNA Klonen (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...