Name: a protocol to evaluate and quantify retinal pigmented epithelium pathologies in mouse models of age-related macular degeneration
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration at JoVE.com

Yazarlar, dokularımızı ışık mikroskobu için hazırladıkları için Satoshi Kinoshita ve Wisconsin Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri laboratuvarına (TRIP) teşekkür etmek ister. Bu çekirdek, UW Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü, Wisconsin Üniversitesi Carbone Kanser Merkezi (P30 CA014520) ve Direktör-NIH Ofisi (S10OD023526) tarafından desteklenmektedir. Konfokal mikroskopi, UW Biyokimya Vakfı Bölümü'nün desteğiyle kurulan UW Biyokimya Optik Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY022086'dan A. Ikeda'ya; R01EY031748'den C. Bowes Rickman'a; P30EY016665 UW Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümüne; P30EY005722 Duke Göz Merkezi'ne; NIH T32EY027721 - M. Landowski; F32EY032766 - M. Landowski), Timothy William Alabalık Başkanlığı (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Ödülü (C. Bowes Rickman); ve Körlüğü Önleme Araştırması'ndan (Duke Göz Merkezi) sınırsız bir hibe.

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı ile uyumludur.
1. Fare RPE'sinin ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi
<ol><li>Bir cam şişede oda sıcaklığında (RT) son konsantrasyonu% 2 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit...

<ol>
	<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).</li><li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+to+study+retinal+pigment+epithelium-related+pathogenesis+in+age-related+macular+degeneration.">Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).</li><li>Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+models+and+therapies+for+age-related+macular+degeneration.">Cellular models and therapies for age-related macular degeneration.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).</li><li>Landowski, M., Bowes Rickman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+lipid+metabolism+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration:+Insights+from+preclinical+mouse+models.">Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).</li><li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+age+related+macular+degeneration.">Animal models of age related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).</li><li>Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+retinal+diseases+and+their+applicability+in+drug+discovery.">Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperreflective+foci,+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration,+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium.">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).</li><li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+complement+factor+H+prevents+age-related+macular+degeneration-like+retina+damage+and+kidney+abnormalities+in+aged+Cfh+knockout+mice.">Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice.</a> The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).</li><li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration.">The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li><li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-amyloid+therapy+protects+against+retinal+pigmented+epithelium+damage+and+vision+loss+in+a+model+of+age-related+macular+degeneration.">Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+histologic+findings+in+age-related+macular+degeneration+with+RPE+flatmount+images.">Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images.</a> Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li><li>Gambril, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+retinal+pigment+epithelium+dysmorphia+and+loss+of+histologic+autofluorescence+in+age-related+macular+degeneration.">Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).</li><li>Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+atrophy:+a+histopathological+assessment.">Geographic atrophy: a histopathological assessment.</a> JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).</li><li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+retinal+pigment+epithelium+phenotypes+in+the+transition+to+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration.">Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Retina. 36, 12-25 (2016).</li><li>Sura, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+contributions+of+basal+laminar+deposit+and+Bruch's+membrane+in+age-related+macular+degeneration.">Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+morphology+of+human+macular+and+peripheral+Bruch's+membrane+in+older+eyes.">Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes.</a> Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biometrics,+impact,+and+significance+of+basal+linear+deposit+and+subretinal+drusenoid+deposit+in+age-related+macular+degeneration.">Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).</li><li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry.">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning.">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).</li><li>Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial-section+electron+microscopy+using+automated+tape-collecting+ultramicrotome+(ATUM).">Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM).</a> Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).</li><li>Yamaguchi, M., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+of+microorganisms+in+transmission+electron+microscopy.">A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).</li><li>Landowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Tmem135+leads+to+retinal+pigmented+epithelium+pathologies+in+mice.">Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+age-related+changes+to+the+elastic+lamina+of+Bruch's+membrane+in+mice.">Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+cell+multinucleation+in+the+aging+eye+-+a+mechanism+to+repair+damage+and+maintain+homoeostasis.">Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis.</a> Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).</li><li>Ort&#237;n-Mart&#237;nez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors:+differences+between+an+albino+(Swiss)+and+a+pigmented+(C57/BL6)+strain.">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).</li><li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-topographic+maps+for+regionally+enhanced+analysis+of+visual+space+in+the+mouse+retina.">Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Potential+targets+for+protection+in+age-related+macular+degeneration.">Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).</li><li>Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+fundus+and+retinal+studies+with+SD-OCT:+a+comparison+of+five+mouse+inbred+strains.">Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains.</a> Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).</li><li>Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+correlation+of+mouse+photoreceptor-RPE+thickness+between+SD-OCT+and+histology.">Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).</li><li>Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+assessments+of+ocular+disease+in+rodent+models+using+optical+coherence+tomography.">In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li></ol>

Bu yazıda, fare modellerinin yapısal RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanıtıldı. Işık, transmisyon elektronu ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri için gözlerin işlenmesi için gerekli adımları ve bu görüntüleme yöntemleriyle gözlenen tipik patolojilerin nicelleştirilmesini tanımladık. RPE fenotipleme protokolümüzün etkinliğini, Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerini inceleyerek kanıtladık, çünkü bu fa...

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır1. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD2'de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır3. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri 4,5 ve fareler 6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli modeller mevcuttur. Yakın tarihli bir rapor, RPE hücre kültürü modelleri4 için standartlaştırılmış protokolleri ve kalite kontrol kriterlerini tanımlamıştır, ancak hiçbir rapor fare modellerinde RPE'nin fenotiplemesini standartlaştırmaya çalışmamıştır. Aslında, AMD'nin fare modelleri üzerine yapılan birçok yayın, RPE'nin tam bir tanımından veya içlerindeki RPE patolojilerinin nicelleştirilmesinden yoksundur. Bu protokolün genel amacı, AMD fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.
Önceki yayınlar, üç görüntüleme tekniği ile farelerde çeşitli RPE patolojilerinin varlığına dikkat çekmiştir. Örneğin, ışık mikroskobu, araştırmacıların murin retinasının brüt morfolojisini görmelerini (Şekil 1A) ve RPE incelmesi, vakuolizasyon ve göç gibi RPE patolojilerini tespit etmelerini sağlar. Bir AMD fare modelindeki RPE inceltmesi, RPE yüksekliğindeki ilgili kontrollerden sapma ile örneklendirilir (Şekil 1B). RPE vakuolizasyonu iki ayrı kategoriye ayrılabilir: mikrovakuolizasyon (Şekil 1C) ve makrovakuolizasyon (Şekil 1D). RPE mikrovakuolizasyonu, RPE'de toplam yüksekliğini etkilemeyen vakuollerin varlığı ile özetlenirken, makrovakuolizasyon, fotoreseptörlerin dış segmentlerine çıkıntı yapan vakuollerin varlığı ile gösterilir. RPE migrasyonu, retinal bir kesitte RPE tek katmanının üzerindeki pigmentin fokal agregası ile ayırt edilir (Şekil 1E). AMD donör gözlerindeki göçmen RPE hücrelerinin, farklılaşma kümesi 68 (CD68)9 gibi immünoreaktivite gösterdikleri ve RPE enkazını veya transdiferansiyasyon9 geçiren RPE'yi yutan bağışıklık hücrelerini temsil edebileceği unutulmamalıdır. İletim elektron mikroskobu adı verilen başka bir görüntüleme tekniği, araştırmacıların RPE'nin ve bazal zarının ultrayapısını görselleştirmelerine izin verebilir (Şekil 2A). Bu teknik, bazal laminer tortu (BLamD) olarak bilinen farelerde baskın sub-RPE birikintisini tanımlayabilir (Şekil 2B)10. Son olarak, konfokal mikroskopi, RPE düz montajlarını görüntüleyerek RPE hücrelerinin yapısını ortaya çıkarabilir (Şekil 3A). Bu yöntem, RPE dismorfisini, RPE'nin klasik petek şeklinden sapmasını ortaya çıkarabilir (Şekil 3B). Ayrıca RPE multinükleasyonunu, bir RPE hücresi içinde üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını tespit edebilir (Şekil 3C). Mevcut AMD fare modellerinde bulunan RPE patolojilerinin bir özeti için, araştırmacıları literatürden bu incelemelere yönlendiriyoruz 6,7.
AMD'yi inceleyen araştırmacılar, fenotipleme protokolünden önce RPE patolojilerini araştırmak için fare kullanmanın avantaj ve dezavantajlarının farkında olmalıdır. Fareler, nispeten kısa ömürleri ve maliyet etkinliklerinin yanı sıra genetik ve farmakolojik manipüle edilebilirlikleri nedeniyle avantajlıdır. Fareler ayrıca AMD donör gözlerindegözlenen RPE göçü, dismorfi ve çoklu çekirdeklenme dahil olmak üzere RPE dejeneratif değişiklikler sergiler 11,12,13,14,15,16,17; bu, benzer mekanizmaların farelerde ve insanlarda bu RPE patolojilerinin gelişiminin altında yatabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, fare çalışmalarının insan AMD'sine çevrilebilirliğini sınırlayan önemli farklılıklar vardır. İlk olarak, farelerde AMD'de tercihen etkilenen görme keskinliği için gerekli olan insan retinasının anatomik olarak farklı bir bölgesi olan bir makula yoktur. İkincisi, farelerde RPE incelmesi ve vakuolizasyon gibi bazı RPE patolojileri tipik olarak AMD donör gözlerinde görülmez18. Üçüncüsü, fareler AMD patolojisinin ayırt edici bir özelliği olan drusen geliştirmezler19. Drusen, RPE bazal lamina ile Bruch zarının (BrM) iç kollajenöz tabakası arasında oluşan çok az bazal membran proteinine sahip lipit ve protein içeren birikintilerdir19. Drusen, farelerde ortak alt RPE birikintisi olan BLamD'den hem bileşimlerinde hem de anatomik konumlarında farklılık gösterir. BLamD'ler, BrM'nin RPE bazal laminası ile RPE20'nin bazal kıvrımları arasında oluşan yaşa ve strese bağlı hücre dışı matriks ile zenginleştirilmiş anormalliklerdir. İlginç bir şekilde, BLamD'ler hem farelerde hem de insanlarda benzer bir protein bileşimine ve görünümüne sahiptir 6,10,21. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BLamD'lerin AMD'nin sonraki aşamalarına ilerlemesini etkileyerek AMD'nin patobiyolojisinde hareket edebileceğini düşündürmektedir18,22; Bu nedenle, bu birikintiler fare retinasında hastalıklı RPE'yi temsil edebilir. Bu faydalar ve sınırlamalar hakkında bilgi sahibi olmak, fare çalışmalarından elde edilen sonuçları AMD'ye çevirmek isteyen araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.
Bu protokolde, RPE patolojilerini görselleştirmek için gözleri ışığa, iletim elektronuna ve konfokal mikroskopiye hazırlama yöntemlerini tartışıyoruz. Ayrıca, istatistiksel testler için RPE patolojilerinin tarafsız bir şekilde nasıl ölçüleceğini de açıklıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, transmembran protein 135- (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip (WT) C57BL / 6J farelerde gözlenen yapısal RPE patolojilerini araştırmak için RPE fenotipleme protokolünü kullanıyoruz. Özetle, AMD fare modellerinde RPE'yi karakterize etmek için fenotipleme metodolojisini tanımlamayı amaçlıyoruz, çünkü şu anda standart protokoller mevcut değildir. AMD fare modellerinde de etkilenen fotoreseptörlerin veya koroidin patolojilerini incelemek ve ölçmek isteyen araştırmacılar, bu protokolü çalışmaları için yararlı bulamayabilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2</td>
			<td>PolyScientiifc R&#38;D Company</td>
			<td>S1619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Capacity Slide Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Two are needed for this protocol (one for H&#38;E-stained slides and one for RPE flat mounts.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol&#160;</td>
			<td>MDS Warehouse</td>
			<td>2292-CASE</td>
			<td>Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>11069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Premade 1x PBS can be used in this protocol.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-283-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 inch PVC Tubing with Luer Ends</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1376778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>T400-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>MDS Warehouse</td>
			<td>2293-CASE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable 237 ml&#160; Spray Bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z192546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4&#34; Length, 1 mm Tip Width</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td>Known as curved forceps in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65575-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Euthanasia Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Flow Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castaloy Prong Extension Clamps</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cast-Iron L-shaped Base Support Stand</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-474-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Prolifer Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available to download: https://cellprofiler.org/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost Microscope Slides Lavender</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled H20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4984</td>
			<td>Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Grid Holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71147-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPON 815 Resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22050460</td>
			<td>Please follow manufacturer&#39;s protocol when using this tissue marking dye.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Mounting Media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-110-610</td>
			<td>Use for mounting H&#38;E slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td>Light source for dissecting microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available to download: https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexaframe Castaloy Hook Connector</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>14-666-18Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16537-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Benchtop Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Cryo Tag Labels</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77564-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM UC7Ultramicrotome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Reichert Ultracut S Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifterSlips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22X22I24788001LS</td>
			<td>Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td>Known as micro-dissecting scissors in protocol.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5&#34; Overall Length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td>Known as curved scissors in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube racks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1RS Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21909-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>21909-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>20412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow Tray for Mouse Perfusions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Eosin Y Alcoholic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>642736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Rack for Staining</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squared Cover Glass Slips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish with Cover</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>49WF30</td>
			<td>Need 15 for H&#38;E staining procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>S7510-50</td>
			<td>Use only the syringe barrel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1464917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Use for mounting RPE flat mounts.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22050283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65575-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol to evaluate and quantify retinal pigmented epithelium pathologies in mouse models of age-related macular degeneration

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), yaşlanan popülasyonlarda zayıflatıcı bir retina hastalığıdır. Retinal pigmente epitel (RPE) disfonksiyonunun YBMD'de önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanılmaktadır. RPE disfonksiyonuna yol açan mekanizmaları anlamak için, fare modelleri araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Önceki çalışmalarla, farelerin, bazıları AMD tanısı alan bireylerin gözlerinde gözlenen RPE patolojileri geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, farelerde RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanımlanmaktadır. Bu protokol, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak retinal kesitlerin hazırlanmasını ve değerlendirilmesini ve ayrıca konfokal mikroskopi ile RPE düz montajlarının hazırlanmasını ve değerlendirilmesini içerir. Bu tekniklerle gözlemlenen yaygın murin RPE patolojileri türlerini ve bunları istatistiksel testler için tarafsız yöntemlerle ölçmenin yollarını detaylandırıyoruz. Kavram kanıtı olarak, bu RPE fenotipleme protokolünü, transmembran protein 135'i (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip C57BL / 6J farelerde gözlenen RPE patolojilerini ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün temel amacı, AMD'nin fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünün tamamlanması, AMD'nin fare modellerinde yaygın olarak gözlenen yapısal RPE anormalliklerinin nicel bir analizini sağlar. Bu protokolün etkinliğini doğrulamak için, tavuk beta-aktin promotörü (Tmem135 TG)30 ve yaşlı C57BL / 6J fareleri31,32 tarafından tahrik edilen WT Tmem135'i aşırı eksprese eden transgenik fareler de dahil olmak üzere RPE patolojileri göste...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration at JoVE.com

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Bu protokol, ışık geçirgenliği elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak RP patolojileri için fare boyutunun nasıl işleneceğini ve değerlendirileceğini açıklayan ilk protokoldür. Bu protokolün temel avantajı, RP patolojilerinin kantitatif değerlendirmelerinin dahil edilmesi, istatistiksel karşılaştırmalar için bu üç görüntüleme tekniğinin kullanılmasıdır. Bu protokolde açıklanan teknikler, RPE sağlığı için önemli olan moleküler yollar hakkındaki bilgimizi genişletmeye de yardımcı olabilir.Daha önce fare boyutunu disseke etmemiş kişiler bu protokolle mücadele edebilir. Bu bireylere, bu protokolde açıklanan tekniklerde ustalaşmak için bazı farelerle pratik yapmalarını öneririz. Başlamak için, bir duman başlığında kardiyak perfüzyon için emici bir alt ped üzerinde bir yerçekimi besleme perfüzyon sistemi hazırlayın.Perfüzyon sisteminin şırınga fıçısına 40 mililitre taze hazırlanmış fiksatif tampon dökün. Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için vanayı boru hattına paralel olarak çevirin. Tüm hava kabarcıkları hattan çıkarılana kadar çizgiyi yıkayın.Ardından, tamponun boru hattına akmasını önlemek için valfi boru hattına dik olarak çevirin. Kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek için, ötenazi fareyi perfüzyon sisteminin yakınındaki sığ bir tepsiye aktarın. Karın yukarı bakacak şekilde.Karnı% 70 etanol ile püskürtün, ardından göğüs kafesinin altındaki farenin sol tarafındaki deri ve karın duvarından kavisli makas ve forseps kullanarak beş santimetre aşağı kesim oluşturun. Alt kesimin üstündeki cilt ve karın duvarından üç santimetrelik bir medial kesim yapmaya devam edin. Medialin sonunda, göğüs kafesinin altındaki farenin en uzak sağ tarafındaki deri ve karın duvarından beş santimetre daha aşağı kesim yapın.Kavisli forsepsli abdominal cilt flebini çıkarmak için üç santimetrelik bir medial kesi daha yapın. Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve sternumu kesin. Gösterge iğnesini kalbin sol ventrikülüne yerleştirin ve kapağı çevirin.Kanın ve fiksatifin kalpten çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kavisli makasla kesin. 10 mililitre fiksatif tamponun fareyi bir ila iki dakika boyunca veya karaciğerin rengi soluklaşana ve sağ atriyumdan kan akmayana kadar perfüze etmesine izin verin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, tampon akışını durdurmak için vanayı boru hattına dik olarak çevirin.Gözleri çekirdeklendirmek için, fareyi sığ tepsiden çıkarın ve bir duman başlığındaki emici alt pedin üzerine yerleştirin. Ardından, farenin kafasını sol gözü deneyciye bakacak ve sağ gözü görüş alanı dışında olacak şekilde yönlendirin. Gözün üst tarafına bir doku işaretleme boyası ile açıklama ekleyin.Gözün göz yuvasından çıkıntı yapması için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafını yavaşça aşağı doğru itin. Daha sonra kavisli makas kullanarak, gözü bıçakla göz yuvasından 30 derecelik bir açıyla tutun ve gözün etrafını kesin. Göz küresini kavisli forseps ile kafadan çıkarın ve emici bir alt pedin üzerine yerleştirin.Korneayı 11 numaralı neşter bıçağı ile çırpın ve kavisli forsepsli gözü iki mililitre fiksatif tampon içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Her iki gözü de çekirdeklendirdikten sonra, onları 75 rpm hızında dört derecelik bir odada bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca fiksatif bir tamponda inkübe edin. Ertesi gün, fiksatif tamponu iki mililitre PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin.Posterior segmentler oluşturmanın yanında, gözü diseksiyon mikroskobu altında PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Herhangi bir yağ ve kası ince uçlu forsepslerle göz küresinden yavaşça kaldırın. Göz küresi düzgün bir mavimsi-siyah renge sahip olana kadar yağ ve kası mikro diseksiyon makası ile göz küresine paralel bir yönde dikkatlice kesin Kornea delinme bölgesine ince uçlu forsepsler yerleştirin ve kornea ve irisi göz küresinden çıkarmak için delinme bölgesinden başlayarak korneanın çevresini mikro disseksiyon makası ile kesin.Daha sonra ince uçlu forseps kullanarak, arka segmenti oluşturmak için lensi göz küresinden yavaşça çıkarın. Arka segmenti iki mililitre PBS içeren bir tüpe yerleştirin ve kullanıma kadar buzdolabında dört santigrat derecede saklayın. Gözü PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve gösterildiği gibi kornea ve irisi çıkarın.İnce uçlu forsepslerle lensi dışarı çekin. Daha sonra iki ince uçlu forseps kullanarak, nöral retinayı arka segmentten yavaşça ayırın. Arka göz kepçesinden çıkarmak için optik sinir başındaki nöral retinayı dikkatlice kesin.Göz kabini beş mikrolitre PBS içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Arka göz kaplarını sabitlemek için, dokuya 500 mikrolitre metanol ekleyin ve beş dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Metanol fiksasyonunu iki saat boyunca son inkübasyonla üç kez tekrarlayın.Fiksasyondan sonra, konfokal mikroskopi ile immünofloresan boyama ve görselleştirmeye geçmeden önce dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Dört aylık TMEM 135 TG fareleri, retinal pigmentli epitel veya RPE kalınlığında, optik sinirden 600 ve 900 mikrometre uzaklıkta, yaşa uygun vahşi tip farelere göre anlamlı bir azalma gösterdi. 325 günlük WT ve TMEM 135 TG farelerin mikrovasküolizasyonu, makrovakuolizasyonu ve migrasyonunu içeren RPE patolojilerinin vakaları hesaplandı.RPE mikrovakuolizasyonunun ortalama sıklığı, TMEM 135 TG farelere kıyasla vahşi tipte daha düşüktü. TMEM 135 TG farelerde gözlenen ortalama değerlere kıyasla vahşi tipte RPE makrovakuolizasyonu ve migrasyonu tespit edilmedi. Transmisyon elektron mikroskobunda 24 aylık retinalarda bazal laminer birikintiler gözlenirken, iki aylık retinalarda yoktu.Bazal laminer birikinti yüksekliklerinin kümülatif frekanslarının analizi, 24 aylık farelerde birikintilerde bir artış olduğunu göstererek, iki aylık olana kıyasla, 24 aylık için çizginin sağına doğru bir kayma olduğunu göstermiştir. Bu gözlem, 24 aylık retinalarda daha büyük ortalama yüksekliklerle desteklendi. Dört aylık TMEM 135 TG farelerde RPE dismorfikti.TMEM 135 TG retinalarındaki RPE, yaşa uygun vahşi tip retinalardan daha büyük ve daha az yoğundur. Ayrıca, TG retinalarında kontrollere kıyasla daha fazla çok çekirdekli RPE hücresi gözlendi. Bu protokolü takiben araştırmacılar, farelerde moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak spesifik yolları değerlendirebilir ve bu da bu RP patolojilerinin farelerde nasıl geliştiğini anlamamıza katkıda bulunabilir.Bu protokol, farelerde RP fenotiplemesinin standartlaştırılmasına yardımcı olacak, bu da fare çalışmalarından elde edilen bulguları diğer AMD modellerine çevirecek ve AMD patobiyolojisini anlamamıza yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...