Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين جرانت 32070811 ، وصندوق اختبار التحليل بجامعة جنوب شرق (الصين) 11240090971. نشكر مختبر المجهر الإلكتروني ومركز التحليل المورفولوجي ، كلية الطب ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.

ملاحظة: تم الإبلاغ عن طريقة تحضير عينة المجهر الإلكتروني النافذ المستخدمة في هذه المقالة سابقا16. من المهم ملاحظة أن اختيار الكواشف وتعديل الجرعة ضروريان اعتمادا على العينة. هناك العديد من الكواشف الكيميائية السامة المستخدمة في عملية تحضير العينات ، لذلك يحتاج المشغل إلى اتخ...

<ol>
	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy.">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy.">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li><li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).</li><li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin,+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions.">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li><li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).</li><li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila:+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability.">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li><li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons.">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope.">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

تميل عينات يرقات ذبابة الفاكهة إلى الالتفاف أثناء الجفاف ، حيث تكون العينات رقيقة ، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الوصلة العصبية العضلية بدقة ، مما يزيد من صعوبة وعبء العمل لإعداد العينة. التحسين التقليدي هو تقصير العينة7 ، لكن العينات كانت لا تزال مجعدة بدرجات مختلفة.
<p...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

يعد المجهر الإلكتروني أحد أكثر الطرق مثالية لدراسة البنية التحتية للمواد البيولوجية التي يمكنها إظهار البنية الداخلية للخلايا بصريا وبدقة على المستوىالنانوي 1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد عملية تحضير العينة والتكلفة العالية ، فإن المجهر الإلكتروني ليس شائعا مثل الفحص المجهري الضوئي. أدت التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني إلى تحسينات كبيرة في جودة الصورة ، بالتزامن مع انخفاض ملحوظ في عبء العمل المرتبط بها. وبالتالي ، فقد لعب المجهر الإلكتروني دورا مهما في تطوير المعرفة العلمية في مجالات متنوعة2.
ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني ممتاز لأداء التلاعب الجيني للتحكم بدقة في التعبير المكاني والزماني للجينات المستهدفة3. إلى جانب ذلك ، تتمتع ذبابة الفاكهة بمزايا فترة نمو قصيرة وتربية سهلة مقارنة بنماذج الثدييات. لذلك ، يستخدم ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في أبحاث التشكل4،5.
في يرقات ذبابة الفاكهة ، يتم توزيع عراوات الوصلة العصبية العضلية (NMJ) على نطاق واسع في العضلات 6,7 ، ويمكن أن يوفر التلوين المناعي ل NMJ بسهولة معلومات عن كمية المشبك العصبي والتشكل 8,9. إن عروات NMJ الموجودةفي العضلات 6 / 7 من المقاطعA 2 وA 3 مناسبة تماما للبحث الكمي والمورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. هذا بسبب حجمها ووفرتها10,11. لذلك ، تعتبر يرقات ذبابة الفاكهة NMJs نموذجا مفيدا لأبحاث علم الأعصاب12.
ومع ذلك ، من الصعب مراقبة البنية التحتية ل NMJ bouton بواسطة TEM. نظرا لأن نافذة المسح للمجهر الإلكتروني النافذ ضيقة ، فمن الصعب وضع عروات NMJ الموزعة على نطاق واسع13. السبب الآخر هو أن جدار جسم ذبابة الفاكهة عرضة للتجعيد أثناء خطوة تجفيف الكحول في بروتوكول تحضيرالعينة 7.
عادة ما تختار الدراسات التقليدية عرواتبين العضلات 6 و 7 من الجزأينA 2 وA 3 كمواد عينة بسبب وفرتها وحجمها14,15. العضلات 6 و 7 من الأجزاءA 2 و A3 أكبر من العضلات الأخرى وتحتوي على المزيد من العروات. ومع ذلك ، عندما تم تحضير العينات للمجهر الإلكتروني ، تميل العينات الثابتة إلى أن تصبح رقيقة وعرضة للتجعيد ، مما يؤدي إلى وضع غير صحيحللعضلات 6 و 7 من الجزأين A2 وA 3.
نبلغ بموجب هذا عن إجراء معالجة جديد أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية لإعدادالعينات 7,16 ، من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق ، وبالتالي تسهيل وضع أفضل للتقاطعات العصبية العضلية ليرقات ذبابة الفاكهة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

برز تقاطع ذبابة الفاكهة العصبي العضلي (NMJ) كنظام نموذجي قيم في مجال علم الأعصاب. يتيح تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر في ذبابة الفاكهة NMJ للباحثين الحصول على معلومات متشابكة ، تشمل كلا من البيانات الكمية حول وفرة المشابك العصبية والرؤى التفصيلية في مورفولوجيتها. ومع ذلك ، فإن التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM يمثلان تحديات للتحليل البنيوي الفائق. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. يبدأ الإجراء بوضع شبكة معدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع أو أنبوب اختبار ، يليه وضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة. يتم وضع شبكة إضافية فوق العينات ، مما يضمن وضعها بين الشبكتين. يتم تجفيف العينات الثابتة تماما واختراقها قبل الشروع في إجراء التضمين. ثم يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي بطريقة ورقة مسطحة ، مما يسمح بإعداد العضلات لتحديد المواقع والتقسيم. بالاستفادة من هذه الخطوات ، يمكن تصور جميع عضلات يرقات ذبابة الفاكهة تحت المجهر الضوئي ، مما يسهل تحديد المواقع والتقسيم لاحقا. تتم إزالة الراتنج الزائد بعدتحديد موقع العضلات 6 و 7 من أجزاء الجسم A2 و A3. يتم إجراء التقسيم التسلسلي الرقيق للغايةللعضلة 6 أو 7.

يتكون جدار جسم يرقة ذبابة الفاكهة من 30 ليفة عضلية يمكن تحديدها مرتبة في نمط منتظم وتبدو وكأنها شريحة رقيقة بعد التشريح والتثبيت21 (الشكل 1 أ). تظل العينة مسطحة أثناء عملية الجفاف بسبب وجود الشبكات المعدنية (الشكل 1B ، C). يتم دفن عضلة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .

تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

يمثل التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM تحديات لتحليل البنية التحتية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. هذه الطريقة المتقدمة لإعداد عينة TEM أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق.يجب أن يكون اختيار الكواشف وتعديل الجرعة ضروريا اعتمادا على نوع العينة. هناك العديد من الكواشف الكيميائية السامة المستخدمة في عملية تحضير العينة. وسيظهر الإجراء شنغ تشينغيوان ، طالب ماجستير من مختبر الدكتور غان غوانغمينغ.للبدء ، قم بتشريح يرقات ذبابة الفاكهة الثالثة المتجولة في محلول يناير ، واحصل على جدار الجسم بالكامل وفقا للإجراءات القياسية. ثبت جدار جسم اليرقات بالمثبت في غرفة التشريح طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بنقل جدار جسم اليرقات من غرفة التشريح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، وشطفه عدة مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم.إصلاح جدار الجسم اليرقات في 1 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعتين. بعد التثبيت ، اغسل العينات عدة مرات بالماء المقطر. أضف 2٪ محلول أسيتات مبولة مشبع في الأنبوب لتلطيخ الوصلة العصبية العضلية PHI.وبعد ساعتين ، شطف العينات بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك باستخدام المقص ، قم بقطع قطعتين مستديرتين من شبكة معدنية بحجم المسام 270 ميكرون. ضع الشبكة المعدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع.ثم ضع اليرقات الثابتة على الشبكة ، متبوعة بوضع شبكة أخرى. جفف العينات بتركيز متزايد من الإيثانول لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات سلزية. ثم شطف العينات مرتين مع أكسيد البروبيلين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منهما.بعد ذلك ، ضع العينات في محلول أكسيد البروبيلين وراتنجات الايبوكسي ، متبوعا براتنجات الايبوكسي النقية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. للتضمين ، قم بقطع فيلم البولي إيثيلين إلى مربع كبير ودعم مستطيل صغير مجوف. الغراء مربع صغير مع مربع كبير.أضف راتنجات الايبوكسي الكافية في وسط المربع الكبير. ثم قم بتشغيل المجسمة ، وضع العينات في راتنجات الايبوكسي الموضوعة مسبقا مع توجيه جانب العضلات لأعلى. أضف عدة قطرات من راتنجات الايبوكسي على العينات ، وقم بتغطيتها بفيلم البولي إيثيلين.ضع عينات البلمرة في درجات حرارة متزايدة لمدة 24 ساعة لكل منها. بعد البلمرة ، باستخدام شفرة حادة ، قم بإزالة الأجزاء الزائدة من جسم اليرقات مع الاحتفاظ بشبه منحرف ، بما في ذلك الجزء A2 و A3. قم بإزالة شبه المنحرف من جدار جسم اليرقات المتبقي ، وقم بإرفاقه بالكبسولة المملوءة بالراتنج باستخدام غراء AB.تحت المجهر الضوئي ، تأكد من موضع العضلات السادسة والسابعة من الجزأين A2 و A3 ، مع الحفاظ على مستوى الظل الموازي للعضلة السادسة. ثم اقطع خمس العينة على طول جانبي الجزء A3. باستخدام ميكروتوم ، قم بإعداد قسم رفيع جدا من العينة بدءا من العضلة السادسة.بعد التقسيم ، قم بتوصيل أكبر عدد ممكن من الشرائح بكل شبكة نحاسية. استخدم المجهر الإلكتروني النافذ لمراقبة العينات. من بين راتنج Lowicryl K4M وراتنجات الايبوكسي ، قدم راتنج Lowicryl K4M نتائج أكثر حدة ويمكن ملاحظتها بسهولة أكبر لعضلات جسم ذبابة الفاكهة.أظهر التصوير البؤري تصورا محسنا للوصلة العصبية العضلية بين العضلات السادسة والسابعة. كشف المجهر الإلكتروني النافذ عن تقاطعات عصبية عضلية تشبه الخرز ، مما يوفر معلومات بنية متشابكة محسنة. ظلت العينات مسطحة طوال عملية الجفاف بسبب تقييد الشبكات المعدنية.إلى جانب ذلك ، تم بلمرة العينات بين المنتجات البلاستيكية ، مما منع العينات من الطي. في المستقبل ، يمكن تطبيق طريقة تحضير عينة TEM على الدماغ والحبل العصبي البطني ، وبالتالي تحسين إمكانات أبحاث البنية الفائقة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

مشهي التعلم النقابي في الشم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

تستخدم علفا بروتوكول مسار طول ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

إعداد نموذج لتحليل اندوبيبتيدوميك في السائل الدماغي النخاعي البشرية

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

عضلة رافعة أوريس التحضير لدراسة انتقال الأعصاب الثدييات المشبك في ظروف الجهد

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...