Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation des sciences naturelles de Chine 32070811 et le Fonds d’essai d’analyse de l’Université du Sud-Est (Chine) 11240090971. Nous remercions le Laboratoire de microscopie électronique et le Centre d’analyse morphologique, École de médecine, Université du Sud-Est, Nanjing, Chine.

REMARQUE : La méthode de préparation d’échantillon de microscopie électronique à transmission utilisée dans cet article a été décrite précédemment16. Il est important de noter que la sélection des réactifs et l’ajustement de la posologie sont nécessaires en fonction de l’échantillon. De nombreux réactifs chimiques toxiques sont utilisés dans le processus de préparation des échantillons, par conséquent, l’opérateur doit prendre certaines mesures de protection, telles q...

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	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

Les échantillons de larves de drosophile ont tendance à se recroqueviller pendant la déshydratation, car les échantillons sont minces, ce qui rend difficile la localisation précise de la jonction neuromusculaire, augmentant ainsi la difficulté et la charge de travail pour la préparation des échantillons. L’amélioration traditionnelle consiste à raccourcir l’échantillon7, mais les échantillons étaient toujours enroulés à des degrés différents.
<p class="jove_conten...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

La microscopie électronique est l’une des méthodes les plus idéales pour étudier l’ultrastructure des matériaux biologiques qui permet de démontrer visuellement et avec précision la structure interne des cellules au niveau1 à l’échelle nanométrique. Cependant, en raison de la complexité du processus de préparation des échantillons et du coût élevé, la microscopie électronique n’est pas aussi populaire que la microscopie optique. Les progrès récents des techniques de microscopie électronique ont permis d’améliorer considérablement la qualité des images, ce qui a coïncidé avec une réduction remarquable de la charge de travail associée. Par conséquent, la microscopie électronique a joué un rôle important dans l’avancement des connaissances scientifiques dans divers domaines2.
La drosophile est un excellent modèle animal pour effectuer des manipulations génétiques afin de contrôler précisément l’expression spatiale et temporelle des gènes cibles3. De plus, la drosophile présente les avantages d’une courte période de croissance et d’un élevage facile par rapport aux modèles mammifères ; par conséquent, la drosophile est largement utilisée dans la recherche morphologique 4,5.
Chez les larves de drosophile, les boutons de jonction neuromusculaire (JNM) sont largement répartis dans les muscles 6,7, et l’immunocoloration de la JNM peut facilement fournir des informations sur la quantité et la morphologie des synapses 8,9 . Les boutons NMJ situés dans les muscles 6e/7des segments A2 et A3 sont bien adaptés à la recherche quantitative et morphologique par microscopie optique. C’est à cause de leur taille et de leur abondance10,11. Par conséquent, les larves de drosophile sont considérées comme un modèle utile pour la recherche en neurosciences12.
Cependant, il est difficile d’observer l’ultrastructure du bouton NMJ par le TEM. Étant donné que la fenêtre de balayage de la microscopie électronique à transmission est étroite, il est difficile de positionner les boutons NMJ13 largement distribués. L’autre raison est que la paroi corporelle de la drosophile est susceptible de s’enrouler pendant l’étape de déshydratation alcoolique du protocole de préparation des échantillons7.
Les études traditionnelles ont généralement choisi des boutons entre les 6ème et 7ème muscles dessegments A2 et A3 comme matériaux d’échantillonnage en raison de leur abondance et de leur taille14,15. Les 6eet 7emuscles des segments A2 et A3 sont plus gros que les autres muscles et contiennent plus de boutons. Cependant, lorsque des échantillons ont été préparés pour la microscopie électronique, les échantillons fixes avaient tendance à devenir minces et sujets à l’enroulement, ce qui entraînait un mauvais positionnement des 6e et 7e muscles des segments A2 et A3.
Nous rapportons ici une nouvelle procédure de traitement qui est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle de préparation des échantillons 7,16, en permettant aux échantillons de rester plats pendant la déshydratation ultérieure, facilitant ainsi un meilleur positionnement des jonctions neuromusculaires larvaires de la drosophile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

La jonction neuromusculaire (JNM) de la drosophile est devenue un système modèle précieux dans le domaine des neurosciences. L’application de la microscopie confocale chez la drosophile NMJ permet aux chercheurs d’acquérir des informations synaptiques, englobant à la fois des données quantitatives sur l’abondance des synapses et des informations détaillées sur leur morphologie. Cependant, la distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse ultrastructurale. Cette étude présente une méthode innovante et efficace de préparation des échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. La procédure commence par la mise en place d’un treillis métallique à la base d’une bouteille ou d’un tube à essai à fond plat, puis par le positionnement d’échantillons de larves fixes sur le treillis. Un maillage supplémentaire est placé sur les échantillons, en veillant à ce qu’ils soient positionnés entre les deux mailles. Les échantillons fixés sont soigneusement déshydratés et infiltrés avant de procéder à la procédure d’enrobage. Ensuite, l’enrobage des échantillons dans de la résine époxy est effectué à plat, ce qui permet de préparer les muscles pour le positionnement et la section. Grâce à ces étapes, tous les muscles des larves de drosophile peuvent être visualisés en microscopie optique, ce qui facilite le positionnement et la sectionnement ultérieurs. L’excès de résine est éliminé après avoir localisé les 6e et 7e muscles des segments corporels A, 2 et A, 3. Une section ultra-mince en série du 6ème ou 7ème muscle est effectuée.

La paroi corporelle de la larve de drosophile est composée de 30 fibres musculaires identifiables disposées de manière régulière et ressemble à une fine tranche après dissection et fixation21 (Figure 1A). L’échantillon reste plat pendant le processus de déshydratation en raison de la présence de treillis métalliques (Figure 1B, C). Le muscle du corps larvaire est enfoui dans une fine plaque de résin...

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Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .

Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

La distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse de l’infrastructure. Ce protocole présente une méthode innovante et efficace de préparation d’échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. Cette méthode avancée de préparation des échantillons TEM est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle en permettant aux échantillons de rester plats pendant la déshydratation ultérieure.La sélection des réactifs et l’ajustement de la posologie doivent être nécessaires en fonction du type d’échantillon. De nombreux réactifs chimiques toxiques sont utilisés dans le processus de préparation des échantillons. La démonstration de la procédure sera assurée par Sheng Qingyuan, un étudiant en master du laboratoire du Dr Gan Guangming.Pour commencer, disséquez les larves de drosophile errantes de la fin du troisième stade dans la solution de janvier et obtenez toute la paroi du corps selon les procédures standard. Fixez la paroi du corps larvaire avec le fixateur dans la chambre de dissection pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez la paroi du corps larvaire de la chambre de dissection dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et rincez-la plusieurs fois avec un tampon de cacodylate de sodium.Fixez la paroi du corps larvaire avec du tétroxyde d’osmium à 1 % pendant deux heures. Après la fixation, laver les échantillons plusieurs fois avec de l’eau distillée. Ajoutez une solution d’acétate d’urinoir saturée à 2 % dans le tube pour colorer la jonction neuromusculaire PHI.Et après deux heures, rincez les échantillons à l’eau déminéralisée. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez deux morceaux ronds de treillis métallique de taille de pore de 270 microns. Placez le treillis métallique à la base d’une bouteille à fond plat.Placez ensuite les larves fixes sur le grillage, puis placez un autre treillis. Déshydratez les échantillons à une concentration croissante d’éthanol pendant 20 minutes chacun à quatre degrés Celsius. Ensuite, rincez deux fois les échantillons avec de l’oxyde de propylène à température ambiante pendant cinq minutes chacun.Ensuite, placez les échantillons dans une solution d’oxyde de propylène et de résine époxy, suivie de résine époxy pure pendant deux heures à température ambiante. Pour l’enrobage, découpez un film de polyéthylène en un grand carré et un petit support rectangulaire creux. Collez le petit carré avec le grand carré.Ajoutez suffisamment de résine époxy au centre du grand carré. Allumez ensuite le stéréoscope et placez les échantillons dans la résine époxy prépositionnée avec le côté musculaire vers le haut. Ajoutez plusieurs gouttes de résine époxy sur les échantillons et recouvrez-les d’un film de polyéthylène.Placez les échantillons pour la polymérisation à des températures croissantes pendant 24 heures chacun. Après polymérisation, à l’aide d’une lame tranchante, retirez les parties en excès du corps larvaire tout en conservant un trapèze, y compris les segments A2 et A3. Retirez le trapèze de la paroi restante du corps larvaire et fixez-le à la capsule remplie de résine avec de la colle AB.Au microscope optique, confirmez la position des sixième et septième muscles des segments A2 et A3, en maintenant le plan tangent parallèle au sixième muscle. Ensuite, coupez un cinquième de l’échantillon le long des deux côtés du segment A3. À l’aide d’un microtome, préparez une section ultra fine de l’échantillon en partant du sixième muscle.Après la section, fixez autant de tranches que possible à chaque maille de cuivre. Utilisez un microscope électronique à transmission pour observer les échantillons. Parmi la résine Lowicryl K4M et la résine époxy, la résine Lowicryl K4M a fourni des résultats plus nets et plus facilement observables des muscles du corps de la drosophile.L’imagerie confocale a démontré une meilleure visualisation de la jonction neuromusculaire entre les sixième et septième muscles. La microscopie électronique à transmission a révélé des jonctions neuromusculaires ressemblant à des billes, offrant des informations améliorées sur la structure synaptique. Les échantillons sont restés plats tout au long du processus de déshydratation en raison de la restriction des mailles métalliques.De plus, les échantillons ont été polymérisés entre les produits en plastique, empêchant les échantillons de se plier. À l’avenir, la méthode de préparation d’échantillons TEM pourra être appliquée au neuropil du cerveau et du cordon nerveux ventral, améliorant ainsi le potentiel de la recherche ultrastructurale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

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Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Génération d’unités motrices humaines avec des jonctions neuromusculaires fonctionnelles dans des dispositifs microfluidiques

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...