Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין מענק 32070811, ו אוניברסיטת דרום מזרח (סין) ניתוח מבחן קרן 11240090971. אנו מודים למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ולמרכז לניתוח מורפולוגי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת דרום-מזרח, נאנג'ינג, סין.

הערה: שיטת הכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת המשמשת במאמר זה דווחה בעבר16. חשוב לציין כי הבחירה של ריאגנטים ואת התאמת המינון נחוצים בהתאם המדגם. ישנם ריאגנטים כימיים רעילים רבים המשמשים בתהליך הכנת הדגימה, ולכן, המפעיל צריך לנקוט באמצעי הגנה מסוימים, כגון לבישת ביגוד מגן ו...

<ol>
	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy.">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy.">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li><li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).</li><li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin,+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions.">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li><li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).</li><li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila:+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability.">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li><li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons.">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope.">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

דגימות זחלי דרוזופילה נוטות להתכרבל במהלך התייבשות, מכיוון שהדגימות דקות, מה שמקשה על איתור מדויק של הצומת העצבית-שרירית, ובכך מגדיל את הקושי ועומס העבודה להכנת הדגימה. השיפור המסורתי הוא קיצור מדגם7, אך הדגימות עדיין היו מסולסלות בדרגות שונות.
בשיטה שלנו ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחת השיטות האידיאליות ביותר לחקר מבנה העל של חומרים ביולוגיים שיכולים להדגים חזותית ומדויקת את המבנה הפנימי של תאים ברמה ננומטרית1. עם זאת, בשל מורכבות תהליך הכנת הדגימה והעלות הגבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים אינו פופולרי כמו מיקרוסקופ אור. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הובילה לשיפור משמעותי באיכות התמונה, במקביל להפחתה יוצאת דופן בעומס העבודה הנלווה. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ אלקטרונים תפס תפקיד חשוב בקידום הידע המדעי בתחומים מגוונים2.
דרוזופילה הוא מודל חייתי מצוין לביצוע מניפולציות גנטיות כדי לשלוט במדויק בביטוי המרחבי והזמני של גני מטרה3. חוץ מזה, לדרוזופילה יש את היתרונות של תקופת גדילה קצרה וגידול קל בהשוואה למודלים של יונקים; לכן, דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב במחקר מורפולוגיה 4,5.
בזחלי דרוזופילה, בוטוני צומת נוירומוסקולרי (NMJ) מופצים באופן נרחב בשרירים 6,7, ו immunostaining של NMJ יכול בקלות לספק מידע על כמות סינפסה ומורפולוגיה 8,9 . בוטי NMJ הממוקמיםבשרירים 6/7 של מקטעי A2 ו- A3 מתאימים היטב למחקר כמותי ומורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אור. הסיבה לכך היא גודלם ושפע10,11. לכן, זחלי דרוזופילה NMJ נחשבים מודל שימושי למחקר מדעי המוח12.
עם זאת, זה מאתגר לצפות NMJ bouton ultrastructure על ידי TEM. מכיוון שחלון הסריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת צר, קשה למקם את הבוטונים NMJ המפוזרים באופן נרחב13. הסיבה השנייה היא שדופן הגוף של דרוזופילה רגישה לסלסול במהלך שלב התייבשות האלכוהול של פרוטוקול הכנת הדגימה7.
מחקרים מסורתיים בדרך כלל בחרו בשרירים בין השרירים ה-6 וה-7 של קטעי A2 ו- A3 כחומרים לדוגמה בגלל השפע והגודל שלהם14,15. השריריםה-6 וה-7 במקטעי A2 ו-A 3 גדולים יותר מהשרירים האחרים ומכילים יותר בוטונים. עם זאת, כאשר הדגימות הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים, דגימות קבועות נטו להיות דקות ונוטות לסלסל, מה שהוביל למיקום לא נכון של השריריםה -6 וה-7 של קטעי A2 ו- A3.
אנו מדווחים בזאת על הליך עיבוד חדש היעיל יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית של הכנת הדגימות 7,16, בכך שהוא מאפשר לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן, ובכך להקל על מיקום טוב יותר של הצמתים העצביים-שריריים של זחל דרוזופילה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

הצומת הנוירומוסקולרית דרוזופילה (NMJ) התפתחה כמערכת מודל רבת ערך בתחום מדעי המוח. היישום של מיקרוסקופ קונפוקלי ב - Drosophila NMJ מאפשר לחוקרים להשיג מידע סינפטי, המקיף הן נתונים כמותיים על שפע סינפסות והן תובנות מפורטות לגבי המורפולוגיה שלהם. עם זאת, ההתפלגות המפוזרת והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח האולטרה-סטרוקטורלי. מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. ההליך מתחיל בהנחת רשת מתכת בבסיס בקבוק או מבחנה בעלת תחתית שטוחה, ולאחר מכן מיקום דגימות זחלים קבועות על הרשת. רשת שינוי נוספת מונחת מעל הדגימות, כדי להבטיח שהן ממוקמות בין שתי רשתות השינוי. הדגימות הקבועות מיובשות היטב ומוחדרות לפני שממשיכים בהליך ההטבעה. לאחר מכן הטבעה של הדגימות בשרף אפוקסי מתבצעת באופן יריעה שטוחה, המאפשרת הכנת שרירים למיקום וחתך. כתוצאה מצעדים אלה, ניתן לדמיין את כל השרירים של זחלי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ אור, ובכך להקל על המיקום והחתך הבאים. עודף שרף מוסר לאחר איתור השרירים ה- 6 וה- 7 של חלקי הגוף A2 ו- A3. מבוצעת חתך טורי דק במיוחד של השריר ה- 6 או ה- 7.

דופן הגוף של זחל דרוזופילה מורכבת מ-30 סיבי שריר הניתנים לזיהוי המסודרים בתבנית רגילה ונראים כמו פרוסה דקה לאחר נתיחה וקיבוע21 (איור 1A). הדגימה נשארת שטוחה במהלך תהליך ההתייבשות עקב נוכחות רשתות המתכת (איור 1B, C). שריר גוף הזחל קבור ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

הפיזור המפוזר והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח התשתיות. פרוטוקול זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. שיטה מתקדמת זו של הכנת דגימות TEM יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית בכך שהיא מאפשרת לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן.הבחירה של ריאגנטים, והתאמת המינון חייב להיות נחוץ בהתאם לסוג המדגם. ישנם ריאגנטים כימיים רעילים רבים המשמשים בתהליך הכנת המדגם. מי שידגים את ההליך יהיה שנג צ'ינג-יואן, סטודנט מאסטר מהמעבדה של ד"ר גן גואנג-מינג.כדי להתחיל, לנתח את זחלי הכוכב השלישי הנודד Drosophila בתמיסת ינואר, ולקבל את כל דופן הגוף על פי ההליכים הסטנדרטיים. מקבעים את דופן גוף הזחל עם הקיבוע בתא הדיסקציה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מעבירים את דופן גוף הזחל מתא הדיסקציה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ושוטפים אותו מספר פעמים עם חיץ נתרן קקודילט.תקן את דופן גוף הזחל ב 1% osmium tetroxide במשך שעתיים. לאחר הקיבוע, לשטוף את הדגימות מספר פעמים עם מים מזוקקים. הוסף 2% תמיסת אצטט משתנה רווי לתוך הצינור כדי להכתים את צומת PHI neuromuscular.ואחרי שעתיים, לשטוף את הדגימות עם מים deionized. הבא באמצעות מספריים, לחתוך שתי חתיכות עגולות של רשת מתכת בגודל נקבוביות 270 מיקרון. הניחו את רשת המתכת בבסיס בקבוק בעל תחתית שטוחה.לאחר מכן מניחים את הזחלים הקבועים על הרשת, ולאחר מכן מניחים רשת נוספת. יש לייבש את הדגימות בריכוז אתנול עולה למשך 20 דקות כל אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הדגימות פעמיים עם פרופילן אוקסיד בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כל אחת.לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתמיסת פרופילן אוקסיד ושרף אפוקסי, ולאחר מכן שרף אפוקסי טהור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. להטבעה, חותכים סרט פוליאתילן לריבוע גדול ותמיכה מלבנית קטנה וחלולה. הדביקו את הריבוע הקטן עם הריבוע הגדול.מוסיפים מספיק שרף אפוקסי במרכז הריבוע הגדול. לאחר מכן הפעילו את הסטריאוסקופ, והניחו את הדגימות בשרף האפוקסי שהוצב מראש כשצד השריר פונה כלפי מעלה. מוסיפים כמה טיפות של שרף אפוקסי על הדגימות, ומכסים אותן בסרט פוליאתילן.הניחו את הדגימות לפילמור בטמפרטורות עולות למשך 24 שעות כל אחת. לאחר פילמור, באמצעות להב חד, להסיר את החלקים העודפים של גוף הזחל תוך שמירה על טרפז, כולל קטע A2 ו A3. הסר את הטרפז מדופן גוף הזחל שנותר, וחבר אותו לקפסולה מלאת השרף עם דבק AB.תחת מיקרוסקופ אור, לאשר את המיקום של השרירים השישי והשביעי של קטעי A2 ו A3, שמירה על המישור המשיק במקביל שריר שישי. לאחר מכן חתכו חמישית מהמדגם לאורך שני הצדדים של קטע A3. בעזרת מיקרוטום, הכינו חלק דק במיוחד של הדגימה החל מהשריר השישי.לאחר החיתוך, חברו כמה שיותר פרוסות לכל רשת נחושת. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לצפות בדגימות. בקרב שרף Lowicryl K4M ושרף אפוקסי, שרף Lowicryl K4M סיפק תוצאות חדות וקלות יותר לצפייה של שרירי הגוף של דרוזופילה.הדמיה קונפוקלית הדגימה הדמיה משופרת של הצומת העצבית-שרירית בין השרירים השישי והשביעי. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת חשף צמתים עצביים-שריריים דמויי חרוזים, והציע מידע משופר על המבנה הסינפטי. הדגימות נותרו שטוחות לאורך כל תהליך ההתייבשות בשל הגבלת רשתות המתכת.מלבד זאת, הדגימות עברו פולימריזציה בין מוצרי הפלסטיק, מה שמנע מהדגימות להתקפל. בעתיד, שיטת הכנת דגימת TEM יכולה להיות מיושמת על נוירופיל המוח וחוט העצב הגחוני, ובכך לשפר את הפוטנציאל של מחקר אולטרה-סטרוקטורלי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...