Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

इस काम को चीन अनुदान 32070811 के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय (चीन) विश्लेषण परीक्षण कोष 11240090971 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला और रूपात्मक विश्लेषण केंद्र, स्कूल ऑफ मेडिसिन, दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय, नानजिंग, चीन का धन्यवाद करते हैं।

नोट: इस आलेख में प्रयुक्त संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयार करने की विधि पहले16 बताई गई है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नमूने के आधार पर अभिकर्मकों का चयन और खुराक का समायोजन आवश्य...

<ol>
	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy.">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy.">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li><li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).</li><li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin,+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions.">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li><li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).</li><li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila:+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability.">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li><li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons.">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope.">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

ड्रोसोफिला लार्वा के नमूने निर्जलीकरण के दौरान कर्ल करते हैं, क्योंकि नमूने पतले होते हैं, जिससे न्यूरोमस्कुलर जंक्शन का सही पता लगाना मुश्किल हो जाता है, जिससे नमूना तैयार करने में कठिनाई और कार्?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैविक सामग्रियों के अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए सबसे आदर्श तरीकों में से एक है जो नैनोस्केल स्तर1 पर कोशिकाओं की आंतरिक संरचना को नेत्रहीन और सटीक रूप से प्रदर्शित कर सकता है। हालांकि, नमूना तैयार करने की प्रक्रिया की जटिलता और उच्च लागत के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रकाश माइक्रोस्कोपी के रूप में लोकप्रिय नहीं है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों में हालिया प्रगति ने छवि गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार किया है, जो संबंधित कार्यभार में उल्लेखनीय कमी के साथ मेल खाता है। नतीजतन, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने विभिन्न क्षेत्रों में वैज्ञानिक ज्ञान को आगे बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाईहै।
ड्रोसोफिला लक्ष्य जीन3 के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति को ठीक से नियंत्रित करने के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ करने के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में स्तनधारी मॉडल की तुलना में कम विकास अवधि और आसान पालन के फायदे हैं; इसलिए, ड्रोसोफिला व्यापक रूप से आकृति विज्ञान अनुसंधान 4,5 में प्रयोग किया जाता है.
ड्रोसोफिला लार्वा में, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) बाउटन व्यापक रूप सेमांसपेशियों 6,7 में वितरित किए जाते हैं, और एनएमजे के इम्यूनोस्टेनिंग आसानी से सिनैप्स मात्रा और आकृति विज्ञान 8,9 पर जानकारी प्रदान कर सकते हैं। ए2 और ए3 खंडों की 6वें/7वें मांसपेशियों में स्थित एनएमजे बाउटन प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मात्रात्मक और रूपात्मक अनुसंधान के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। यह उनके आकार और बहुतायत10,11 की वजह से है. इसलिए, ड्रोसोफिला लार्वा एनएमजे तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान12 के लिए एक उपयोगी मॉडल माना जाता है.
हालांकि, टीईएम द्वारा एनएमजे बाउटन अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण है। चूंकि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की स्कैन विंडो संकीर्ण है, इसलिए व्यापक रूप से वितरित एनएमजे बाउटन13 की स्थिति बनाना मुश्किल है। दूसरा कारण यह है कि ड्रोसोफिला शरीर की दीवार नमूना तैयारी प्रोटोकॉल7 के शराब निर्जलीकरण कदम के दौरान कर्लिंग के लिए अतिसंवेदनशील है.
पारंपरिक अध्ययनों ने आमतौर पर ए2 और ए3 सेगमेंट की 6वीं और 7वीं मांसपेशियों के बीच बाउटन को उनकी बहुतायत और आकार14,15 के कारण नमूना सामग्री के रूप में चुना है। ए2 और ए3 खंडों की 6वीं और 7वीं मांसपेशियां अन्य मांसपेशियों की तुलना में बड़ी होती हैं और इसमें अधिक बुटन होते हैं। हालांकि, जब नमूने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार किए गए थे, तो निश्चित नमूने पतले हो गए और कर्लिंग के लिए प्रवण हो गए, जिससे ए2 और ए3 खंडों की 6वीं और 7वीं मांसपेशियों की अनुचित स्थिति हो गई।
हम इसके द्वारा एक नई प्रसंस्करण प्रक्रिया है किनमूना तैयार 7,16 की पारंपरिक विधि की तुलना में नमूनों की कर्लिंग को रोकने में अधिक प्रभावी है की रिपोर्ट, नमूने बाद निर्जलीकरण के दौरान फ्लैट रहने के लिए अनुमति देकर, जिससे ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शनों की बेहतर स्थिति की सुविधा.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। ड्रोसोफिला एनएमजे में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का अनुप्रयोग शोधकर्ताओं को सिनैप्टिक जानकारी प्राप्त करने में सक्षम बनाता है, जिसमें सिनैप्स बहुतायत पर मात्रात्मक डेटा और उनके आकारिकी में विस्तृत अंतर्दृष्टि दोनों शामिल हैं। हालांकि, टीईएम के फैलाना वितरण और सीमित दृश्य सीमा अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए चुनौतियां पेश करती हैं। यह अध्ययन एक अभिनव और कुशल नमूना तैयार करने की विधि का परिचय देता है जो पारंपरिक दृष्टिकोण को पार करता है। प्रक्रिया एक फ्लैट तल बोतल या टेस्ट ट्यूब के आधार पर एक धातु जाल रखकर शुरू होता है, जाल पर निश्चित लार्वा नमूनों की स्थिति के बाद. नमूनों के ऊपर एक अतिरिक्त जाल रखा जाता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे दो जालों के बीच स्थित हैं। एम्बेडिंग प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले निश्चित नमूने अच्छी तरह से निर्जलित और घुसपैठ किए जाते हैं। फिर एपॉक्सी राल में नमूनों को एम्बेड करना एक फ्लैट शीट तरीके से किया जाता है, जो स्थिति और सेक्शनिंग के लिए मांसपेशियों की तैयारी की अनुमति देता है। इन चरणों से लाभान्वित, ड्रोसोफिला लार्वा की सभी मांसपेशियों को प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत कल्पना की जा सकती है, जिससे बाद की स्थिति और सेक्शनिंग की सुविधा होती है। शरीर के खंड A,2 और A,3 की 6वीं और 7वीं मांसपेशियों का पता लगाने के बाद अतिरिक्त राल हटा दी जाती है। 6वें या 7वें मांसपेशी के सीरियल अल्ट्रा-पतली सेक्शनिंग का प्रदर्शन किया जाता है।

ड्रोसोफिला लार्वा शरीर की दीवार एक नियमित पैटर्न में व्यवस्थित 30 पहचान योग्य मांसपेशी फाइबर से बना है और विच्छेदन औरनिर्धारण 21(चित्रा 1ए)के बाद एक पतली टुकड़ा की तरह दिखता है। ध?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

यह रिपोर्ट ड्रोसोफिला लार्वा में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की कल्पना के लिए एक नई नमूना तैयारी प्रक्रिया प्रदान करती है। यह विधि पारंपरिक विधि की तुलना में नमूनों के कर्लिंग को रोकने में अधिक प्रभावी है और ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शन अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

ड्रोसोफिला लार्वा में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का अनुकूलन

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

टीईएम के विसरित वितरण और सीमित दृश्य सीमा अवसंरचनात्मक विश्लेषण के लिए चुनौतियां पेश करती हैं। यह प्रोटोकॉल एक अभिनव और कुशल नमूना तैयार करने की विधि प्रस्तुत करता है जो पारंपरिक दृष्टिकोण को पार करता है। टीईएम नमूना तैयार करने की यह उन्नत विधि नमूनों को बाद के निर्जलीकरण के दौरान फ्लैट रहने की अनुमति देकर पारंपरिक विधि की तुलना में नमूनों के कर्लिंग को रोकने में अधिक प्रभावी है।अभिकर्मकों का चयन, और नमूना प्रकार के आधार पर खुराक का समायोजन आवश्यक होना चाहिए। नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में कई जहरीले रासायनिक अभिकर्मकों का उपयोग किया जाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन शेंग किंगयुआन होगा, जो डॉ.गन गुआंगमिंग की प्रयोगशाला का एक मास्टर छात्र है।शुरू करने के लिए, जनवरी समाधान में देर से तीसरे इंस्टार ड्रोसोफिला लार्वा भटकने काटना, और मानक प्रक्रियाओं के अनुसार पूरे शरीर की दीवार प्राप्त करते हैं। चार डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदन कक्ष में लगानेवाला के साथ लार्वा शरीर की दीवार को ठीक करें. अगले दिन, विच्छेदन कक्ष से लार्वा शरीर की दीवार को 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे सोडियम कैकोडाइलेट बफर के साथ कई बार कुल्ला।लार्वा शरीर की दीवार को दो घंटे के लिए 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में ठीक करें। निर्धारण के बाद, आसुत जल के साथ कई बार नमूने धो लें. पीएचआई न्यूरोमस्कुलर जंक्शन को दागने के लिए ट्यूब में 2% संतृप्त मूत्रालय एसीटेट समाधान जोड़ें।और दो घंटे के बाद, नमूनों को विआयनीकृत पानी से कुल्ला। कैंची का उपयोग करके, ताकना आकार 270 माइक्रोन के धातु जाल के दो गोल टुकड़े काट लें। धातु की जाली को एक सपाट तल वाली बोतल के आधार पर रखें।फिर जाल पर निश्चित लार्वा रखें, इसके बाद एक और जाल रखें। चार डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 20 मिनट के लिए एक बढ़ती इथेनॉल एकाग्रता में नमूनों निर्जलीकरण. फिर प्रत्येक पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रोपलीन ऑक्साइड के साथ दो बार नमूने कुल्ला.इसके बाद, नमूनों को प्रोपलीन ऑक्साइड और एपॉक्सी राल समाधान में रखें, इसके बाद कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए शुद्ध एपॉक्सी राल रखें। एम्बेडिंग के लिए, एक पॉलीथीन फिल्म को एक बड़े वर्ग और एक छोटे, खोखले आयताकार समर्थन में काट लें। बड़े वर्ग के साथ छोटे वर्ग को गोंद करें।बड़े वर्ग के केंद्र में पर्याप्त एपॉक्सी राल जोड़ें। फिर स्टीरियोस्कोप चालू करें, और नमूनों को पहले से तैनात एपॉक्सी राल में मांसपेशियों की तरफ ऊपर की ओर रखें। नमूनों पर एपॉक्सी राल की कई बूंदें जोड़ें, और उन्हें पॉलीथीन फिल्म के साथ कवर करें।प्रत्येक 24 घंटे के लिए बढ़ते तापमान पर पोलीमराइजेशन के लिए नमूने रखें। पोलीमराइजेशन के बाद, एक तेज ब्लेड का उपयोग करके, ए 2 और ए 3 सेगमेंट सहित एक ट्रेपोज़ॉइड को बनाए रखते हुए लार्वा शरीर के अतिरिक्त हिस्सों को हटा दें। शेष लार्वा शरीर की दीवार से ट्रेपोज़ॉइड निकालें, और इसे एबी गोंद के साथ राल से भरे कैप्सूल में संलग्न करें।एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, ए 2 और ए 3 खंडों की छठी और सातवीं मांसपेशियों की स्थिति की पुष्टि करें, छठी मांसपेशी के समानांतर स्पर्शरेखा विमान को बनाए रखें। फिर A3 खंड के दोनों पक्षों के साथ नमूना का पांचवां हिस्सा काट लें। एक माइक्रोटोम का उपयोग करके, छठी मांसपेशी से शुरू होने वाले नमूने का एक अल्ट्रा पतला खंड तैयार करें।सेक्शनिंग के बाद, प्रत्येक तांबे की जाली के लिए जितना संभव हो उतने स्लाइस संलग्न करें। नमूनों का निरीक्षण करने के लिए एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। Lowicryl K4M राल और epoxy राल के बीच, Lowicryl K4M राल ड्रोसोफिला शरीर की मांसपेशियों के तेज और अधिक आसानी से देखने योग्य परिणाम प्रदान की.कॉन्फोकल इमेजिंग ने छठी और सातवीं मांसपेशियों के बीच न्यूरोमस्कुलर जंक्शन के उन्नत दृश्य का प्रदर्शन किया। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने मनका की तरह न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का खुलासा किया, जो बेहतर सिनैप्टिक संरचना की जानकारी प्रदान करता है। धातु की जाली के प्रतिबंध के कारण निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान नमूने सपाट रहे।इसके अलावा, नमूनों को प्लास्टिक उत्पादों के बीच पोलीमराइज़ किया गया था, जिससे नमूनों को तह करने से रोका जा सके। भविष्य में, टीईएम नमूना तैयार करने की विधि मस्तिष्क और उदर तंत्रिका कॉर्ड न्यूरोपिल पर लागू की जा सकती है, जिससे अल्ट्रास्ट्रक्चरल अनुसंधान की क्षमता में सुधार होता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

ध्यान केंद्रित आयन बीम मिलिंग और मस्तिष्क के ऊतकों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

में Proprioceptors का विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा और pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

क्षुधावर्धक साहचर्य में घ्राण सीखने<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

चारा के लिए पथ-लंबाई प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लार्वा

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

पूर्व embedding Immunohistochemistry और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

में शीत Nociception के लिए उपन्यास परख<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

उंनमनी Auris लंग्स वोल्टेज क्लैंप शर्तों के तहत स्तनधारी Neuromuscular ट्रांसमिशन की परीक्षा के लिए तैयारी

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Neuromuscular विश्लेषण के लिए चूहा मुखर गुना की तैयारी

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के इम्यूनोफ्लोरेटेंट और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एकल कंकाल मांसपेशी फाइबर का विच्छेदन

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के साथ मानव मोटर इकाइयों का उत्पादन

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...