Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China Grant 32070811 og Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Vi takker Laboratory of Electron Microscopy og Center of Morphological Analysis, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, Kina.

NOTAT: Transmisjonselektronmikroskopiprøveforberedelsesmetoden som brukes i denne artikkelen har blitt rapportert tidligere16. Det er viktig å merke seg at valg av reagenser og justering av dosering er nødvendig avhengig av prøven. Det er mange giftige kjemiske reagenser som brukes i prøveprepareringsprosessen, derfor må operatøren ta visse beskyttelsestiltak, for eksempel å bruke verneklær og hansker og operere i et avtrekksskap.
1. Disseksjon, fiksering...

<ol>
	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy.">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy.">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li><li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).</li><li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin,+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions.">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li><li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).</li><li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila:+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability.">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li><li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons.">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope.">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

Drosophila-larveprøver har en tendens til å krølle seg sammen under dehydrering, siden prøvene er tynne, noe som gjør det vanskelig å lokalisere det nevromuskulære krysset nøyaktig, og dermed øke vanskeligheten og arbeidsmengden for prøveforberedelsen. Den tradisjonelle forbedringen er å forkorte prøven7, men prøvene var fortsatt krøllet i ulik grad.
I vår metode er det to kritiske trinn: For det første forblir prøvene flate gjennom hele dehydr...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Elektronmikroskopi er en av de mest ideelle metodene for å studere ultrastrukturen til biologiske materialer som visuelt og nøyaktig kan demonstrere den indre strukturen til celler på nanoskala nivå1. På grunn av kompleksiteten i prøveforberedelsesprosessen og de høye kostnadene, er elektronmikroskopi imidlertid ikke like populær som lysmikroskopi. Nylige fremskritt innen elektronmikroskopiteknikker har ført til betydelige forbedringer i bildekvaliteten, sammenfallende med en bemerkelsesverdig reduksjon i den tilhørende arbeidsmengden. Følgelig har elektronmikroskopi påtatt seg en viktig rolle i å fremme vitenskapelig kunnskap på ulike felt2.
Drosophila er en utmerket dyremodell for å utføre genetiske manipulasjoner for nøyaktig å kontrollere det romlige og tidsmessige uttrykket til målgener3. Dessuten har Drosophila fordelene med en kort vekstperiode og enkel oppdrett sammenlignet med pattedyrmodeller; derfor er Drosophila mye brukt i morfologiforskning 4,5.
Hos Drosophila-larver er nevromuskulære kryss (NMJ) boutons vidt fordelt i musklene 6,7, og immunfarging av NMJ kan lett gi informasjon om synapsemengde og morfologi 8,9 . NMJ-boutonene lokalisert i 6./7.-musklene i A2- ogA-3-segmentene er godt egnet for kvantitativ og morfologisk forskning ved bruk av lysmikroskopi. Dette er på grunn av deres størrelse og overflod10,11. Derfor anses Drosophila-larver NMJ som en nyttig modell for nevrovitenskapelig forskning12.
Det er imidlertid utfordrende å observere NMJ-bouton-ultrastrukturen ved TEM. Siden skannevinduet for transmisjonselektronmikroskopi er smalt, er det vanskelig å plassere de vidt distribuerte NMJ-boutons13. Den andre grunnen er at Drosophila-kroppsveggen er utsatt for krølling under alkoholdehydreringstrinnet i prøveprepareringsprotokollen7.
Tradisjonelle studier har vanligvis valgt boutons mellom6th og7th muskler i A2 og A3 segmentene som prøvematerialer på grunn av deres overflod og størrelse14,15. 6og 7 muskler i A2 og A3 segmentene er større enn de andre musklene og inneholder flere boutons. Men når prøvene ble forberedt for elektronmikroskopi, hadde faste prøver en tendens til å bli tynne og utsatt for krølling, noe som førte til feil plassering av6th og7th muskler i A2 og A3 segmentene.
Vi rapporterer herved en ny behandlingsprosedyre som er mer effektiv for å forhindre krølling av prøvene sammenlignet med den tradisjonelle metoden for prøvepreparering 7,16, ved å la prøvene holde seg flate under den påfølgende dehydreringen, og dermed legge til rette for bedre posisjonering av Drosophila-larvens nevromuskulære kryss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

Drosophila nevromuskulært kryss (NMJ) har dukket opp som et verdifullt modellsystem innen nevrovitenskap. Anvendelsen av konfokalmikroskopi ved Drosophila NMJ gjør det mulig for forskere å skaffe synaptisk informasjon, som omfatter både kvantitative data om synapseoverflod og detaljert innsikt i deres morfologi. Den diffuse fordelingen og det begrensede synsområdet til TEM gir imidlertid utfordringer for den ultrastrukturelle analysen. Denne studien introduserer en innovativ og effektiv prøveprepareringsmetode som overgår den konvensjonelle tilnærmingen. Prosedyren begynner med å plassere et metallnett i bunnen av en flatbunnet flaske eller reagensrør, etterfulgt av plassering av faste larveprøver på nettet. Et ekstra nett plasseres over prøvene, og sikrer at de er plassert mellom de to maskene. De faste prøvene blir grundig dehydrert og infiltrert før de fortsetter med innstøpingsprosedyren. Deretter utføres innstøping av prøvene i epoksyharpiks på en flat arkmåte, noe som gjør det mulig å forberede muskler for posisjonering og seksjonering. Ved å dra nytte av disse trinnene kan alle musklene til Drosophila-larver visualiseres under lysmikroskopi, noe som letter påfølgende posisjonering og seksjonering. Overflødig harpiks fjernes etter å ha lokalisert6th og7th muskler i kroppssegment A2 og A3. Seriell ultratynn seksjonering av den 6eller 7 muskelen utføres.

Drosophila-larvens kroppsvegg er sammensatt av 30 identifiserbare muskelfibre arrangert i et vanlig mønster og ser ut som en tynn skive etter disseksjon og fiksering21 (figur 1A). Prøven forblir flat under dehydreringsprosessen på grunn av tilstedeværelsen av metallnettene (figur 1B, C). Larvekroppsmuskelen er begravet i en tynn plate laget av epoksyharpiks (figur 1D-G</s...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Denne rapporten gir en ny prøveforberedelsesprosedyre for visualisering av nevromuskulære kryss i Drosophila-larver . Denne metoden er mer effektiv for å forhindre krølling av prøvene sammenlignet med den tradisjonelle metoden og er spesielt nyttig for Drosophila nevromuskulær kryss ultrastrukturell analyse.

Optimalisering av prøveforberedelsesprosess for transmisjonselektronmikroskopi av nevromuskulære kryss i Drosophila-larver

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Den diffuse distribusjonen og det begrensede visuelle området til TEM gir utfordringer for infrastrukturanalysen. Denne protokollen presenterer en innovativ og effektiv prøveprepareringsmetode som overgår den konvensjonelle tilnærmingen. Denne avanserte metoden for TEM-prøvepreparering er mer effektiv for å forhindre krølling av prøvene sammenlignet med den tradisjonelle metoden ved å la prøvene holde seg flate under den påfølgende dehydreringen.Valg av reagenser, og justering av dosering må være nødvendig avhengig av prøvetype. Det er mange giftige kjemiske reagenser som brukes i prøveforberedelsesprosessen. Sheng Qingyuan, en masterstudent fra Dr.Gan Guangmings laboratorium, vil demonstrere prosedyren.For å begynne, dissekere de vandrende Drosophila-larvene i slutten av tredje stjernen i Jan-løsningen, og få hele kroppsveggen i henhold til standardprosedyrene. Fest larvekroppsveggen med fikseringsmidlet i disseksjonskammeret over natten ved fire grader Celsius. Dagen etter overfører du larvens kroppsvegg fra disseksjonskammeret til et 1,5 ml sentrifugerør, og skyller det flere ganger med natriumkakodylatbuffer.Fest larvens kroppsvegg i 1% osmiumtetroksid i to timer. Etter fiksering, vask prøvene flere ganger med destillert vann. Tilsett 2% mettet urinalacetatløsning i røret for å farge PHI nevromuskulært kryss.Og etter to timer, skyll prøvene med avionisert vann. Bruk deretter saks til å klippe to runde stykker metallnett med porestørrelse 270 mikron. Plasser metallnettet i bunnen av en flatbunnet flaske.Plasser deretter de faste larvene på nettet, etterfulgt av å plassere et annet nett. Dehydrer prøvene i en økende etanolkonsentrasjon i 20 minutter hver ved fire grader Celsius. Skyll deretter prøvene to ganger med propylenoksid ved romtemperatur i fem minutter hver.Deretter plasserer du prøvene i en propylengoksyd- og epoksyharpiksløsning, etterfulgt av ren epoksyharpiks i to timer ved romtemperatur. For innstøping, kutt en polyetylenfilm i en stor firkant og en liten, hul rektangulær støtte. Lim fast den lille firkanten med den store firkanten.Tilsett tilstrekkelig epoksyharpiks i midten av den store firkanten. Slå deretter på stereoskopet, og plasser prøvene i den forhåndsplasserte epoksyharpiksen med muskelsiden vendt oppover. Tilsett flere dråper epoksyharpiks på prøvene, og dekk dem med polyetylenfilm.Plasser prøvene for polymerisering ved økende temperaturer i 24 timer hver. Etter polymerisasjon, bruk et skarpt blad, fjern overflødige deler av larvelegemet mens du beholder en trapes, inkludert A2- og A3-segmentet. Fjern trapesen fra den gjenværende larvekroppsveggen, og fest den til den harpiksfylte kapselen med AB-lim.Under et lysmikroskop bekrefter du posisjonen til den sjette og syvende muskulaturen i A2- og A3-segmentene, og opprettholder tangentplanet parallelt med den sjette muskelen. Skjær deretter bort en femtedel av prøven langs de to sidene av A3-segmentet. Bruk et mikrotom, forbered en ultratynn del av prøven fra den sjette muskelen.Etter seksjonering, fest så mange skiver som mulig til hvert kobbernett. Bruk et transmisjonselektronmikroskop for å observere prøvene. Blant Lowicryl K4M-harpiks og epoksyharpiks ga Lowicryl K4M-harpiks skarpere og lettere observerbare resultater av Drosophila-kroppsmusklene.Konfokal avbildning viste forbedret visualisering av det nevromuskulære krysset mellom sjette og syvende muskel. Transmisjonselektronmikroskopi avslørte perlelignende nevromuskulære kryss, og ga forbedret synaptisk strukturinformasjon. Prøvene forble flate gjennom hele dehydreringsprosessen på grunn av begrensningen av metallnettene.Dessuten ble prøvene polymerisert mellom plastproduktene, noe som hindret prøvene i å brette seg. I fremtiden kan TEM-prøveprepareringsmetoden brukes på hjernen og ventral nervestrengsnevropil, og dermed forbedre potensialet til ultrastrukturell forskning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Assosiative Olfactory læring i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Sti lengde Protokoll for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Utarbeidelse av ikke-menneskelige primater hjernevev for Pre-embedding Immunohistokjemi og elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel analyse for Cold nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Forberedelse for undersøkelse av pattedyr nevromuskulær overføring Under spenning klemme forhold

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Forberedelse av Rat Vocal Fold for nevromuskulære analyser

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluorescerende og morfometriske analyser av hel-mount nevromuskulære veikryss

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Generering av menneskelige motorenheter med funksjonelle nevromuskulære veikryss i mikrofluidiske enheter

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...