Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of China Grant 32070811 e pelo Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Agradecemos ao Laboratório de Microscopia Eletrônica e Centro de Análise Morfológica, Escola de Medicina, Universidade do Sudeste, Nanjing, China.

NOTA: O método de preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão usado neste artigo foi relatado anteriormente16. É importante notar que a seleção de reagentes e o ajuste da dosagem são necessários dependendo da amostra. Existem muitos reagentes químicos tóxicos usados no processo de preparação da amostra, portanto, o operador precisa tomar certas medidas de proteção, como usar roupas e luvas de proteção e operar em uma capela de exaustão.
<p class="jove_tit...

<ol>
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E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

As amostras de larvas de Drosophila tendem a se enrolar durante a desidratação, pois as amostras são finas, dificultando a localização precisa da junção neuromuscular, aumentando assim a dificuldade e a carga de trabalho para a preparação da amostra. A melhoria tradicional é encurtar a amostra7, mas as amostras ainda estavam enroladas em diferentes graus.
Em nosso método, existem duas etapas críticas: primeiro, as amostras permanecem planas durante ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

A microscopia eletrônica é um dos métodos mais ideais para estudar a ultraestrutura de materiais biológicos que podem demonstrar visualmente e com precisão a estrutura interna das células no nível1 em nanoescala. No entanto, devido à complexidade do processo de preparação da amostra e ao alto custo, a microscopia eletrônica não é tão popular quanto a microscopia de luz. Avanços recentes nas técnicas de microscopia eletrônica levaram a melhorias significativas na qualidade da imagem, coincidindo com uma redução notável na carga de trabalho associada. Consequentemente, a microscopia eletrônica tem assumido um papel importante no avanço do conhecimento científico em diversos campos2.
Drosophila é um excelente modelo animal para realizar manipulações genéticas para controlar com precisão a expressão espacial e temporal de genes-alvo3. Além disso, a Drosophila tem as vantagens de um curto período de crescimento e fácil criação em comparação com os modelos de mamíferos; portanto, Drosophila é amplamente utilizada em pesquisas morfológicas 4,5.
Nas larvas de Drosophila, os botões da junção neuromuscular (NMJ) são amplamente distribuídos nos músculos 6,7, e a imunomarcação da NMJ pode facilmente fornecer informações sobre a quantidade e morfologia das sinapses 8,9. Os botões NMJ localizados nos músculos6º/7º dos segmentos A2 e A3 são adequados para pesquisas quantitativas e morfológicas usando microscopia de luz. Isso se deve ao seu tamanho e abundância10,11. Portanto, as larvas de Drosophila NMJs são consideradas um modelo útil para pesquisas em neurociência12.
No entanto, é desafiador observar a ultraestrutura do botão da JNM pelo MET. Como a janela de varredura da microscopia eletrônica de transmissão é estreita, é difícil posicionar os botões NMJ amplamente distribuídos13. A outra razão é que a parede corporal da Drosophila é suscetível à ondulação durante a etapa de desidratação alcoólica do protocolo de preparação da amostra7.
Estudos tradicionais geralmente escolhem botões entre os músculos 6e 7 dos segmentos A2 e A3 como materiais de amostra devido à sua abundância e tamanho 14,15. Os6º e7º músculos dos segmentos A2 e A3 são maiores que os outros músculos e contêm mais boutons. No entanto, quando as amostras foram preparadas para microscopia eletrônica, as amostras fixas tenderam a se tornar finas e propensas a ondulação, levando ao posicionamento inadequado dos6º e7º músculos dos segmentos A2 e A3.
Relatamos um novo procedimento de processamento que é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional de preparo de amostras 7,16, permitindo que as amostras permaneçam planas durante a desidratação subsequente, facilitando assim um melhor posicionamento das junções neuromusculares larvais de Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

A junção neuromuscular de Drosophila (NMJ) emergiu como um sistema modelo valioso no campo da neurociência. A aplicação da microscopia confocal no Drosophila NMJ permite que os pesquisadores adquiram informações sinápticas, abrangendo dados quantitativos sobre a abundância de sinapses e insights detalhados sobre sua morfologia. No entanto, a distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise ultraestrutural. Este estudo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. O procedimento começa com a colocação de uma malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano ou tubo de ensaio, seguido pelo posicionamento de amostras de larvas fixas na malha. Uma malha adicional é colocada sobre as amostras, garantindo que elas sejam posicionadas entre as duas malhas. As amostras fixas são completamente desidratadas e infiltradas antes de prosseguir com o procedimento de incorporação. Em seguida, a inclusão das amostras em resina epóxi é realizada de forma plana, o que permite a preparação dos músculos para posicionamento e secção. Beneficiando-se dessas etapas, todos os músculos das larvas de Drosophila podem ser visualizados sob microscopia de luz, facilitando o posicionamento e seccionamento subsequentes. O excesso de resina é removido após a localização dos6º e7º músculos dos segmentos corporais A2 e A3. É realizada seccionamento ultrafino em série do6º ou7º músculo.

A parede corporal da larva de Drosophila é composta por 30 fibras musculares identificáveis dispostas em um padrão regular e se parece com uma fatia fina após a dissecção e fixação21 (Figura 1A). A amostra permanece plana durante o processo de desidratação devido à presença das malhas metálicas (Figura 1B, C). O músculo do corpo larval é enterrado em uma placa fina feita de resina epóxi (<strong c...

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Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

A distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise de infraestrutura. Este protocolo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. Este método avançado de preparação de amostras TEM é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional, permitindo que as amostras permaneçam planas durante a desidratação subsequente.A seleção dos reagentes e o ajuste da dosagem devem ser necessários dependendo do tipo de amostra. Existem muitos reagentes químicos tóxicos usados no processo de preparação da amostra. Demonstrando o procedimento estará Sheng Qingyuan, um estudante de mestrado do laboratório do Dr. Gan Guangming.Para começar, disseque as larvas errantes de Drosophila no final do terceiro ínstar em solução de Jan e obtenha toda a parede do corpo de acordo com os procedimentos padrão. Fixe a parede do corpo larval com o fixador na câmara de dissecção durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a parede do corpo larval da câmara de dissecção para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e enxágue-o várias vezes com tampão de cacodilato de sódio.Fixe a parede do corpo larval em tetróxido de ósmio a 1% por duas horas. Após a fixação, lavar as amostras várias vezes com água destilada. Adicione solução de acetato de mictório saturado a 2% no tubo para corar a junção neuromuscular PHI.E depois de duas horas, enxágue as amostras com água deionizada. Em seguida, usando uma tesoura, corte dois pedaços redondos de malha de metal com poros de 270 mícrons. Coloque a malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano.Em seguida, coloque as larvas fixas na malha, seguida da colocação de outra malha. Desidrate as amostras em uma concentração crescente de etanol por 20 minutos cada a quatro graus Celsius. Em seguida, enxaguar as amostras duas vezes com óxido de propileno à temperatura ambiente durante cinco minutos cada.Em seguida, coloque as amostras em uma solução de óxido de propileno e resina epóxi, seguida de resina epóxi pura por duas horas em temperatura ambiente. Para incorporar, corte um filme de polietileno em um grande quadrado e um pequeno suporte retangular oco. Cole o quadrado pequeno com o quadrado grande.Adicione resina epóxi suficiente no centro do grande quadrado. Em seguida, ligue o estereoscópio e coloque as amostras na resina epóxi pré-posicionada com o lado do músculo voltado para cima. Adicione várias gotas de resina epóxi nas amostras e cubra-as com filme de polietileno.Colocar as amostras para polimerização a temperaturas crescentes durante 24 horas cada. Após a polimerização, usando uma lâmina afiada, remova as partes excedentes do corpo larval, mantendo um trapézio, incluindo o segmento A2 e A3. Remova o trapézio da parede restante do corpo larval e prenda-o à cápsula cheia de resina com cola AB.Ao microscópio óptico, confirmar a posição do sexto e sétimo músculos dos segmentos A2 e A3, mantendo o plano tangente paralelo ao sexto músculo. Em seguida, corte um quinto da amostra ao longo dos dois lados do segmento A3. Usando um micrótomo, prepare uma seção ultrafina da amostra a partir do sexto músculo.Após o corte, prenda o máximo de fatias possível a cada malha de cobre. Use um microscópio eletrônico de transmissão para observar as amostras. Entre a resina Lowicryl K4M e a resina epóxi, a resina Lowicryl K4M forneceu resultados mais nítidos e facilmente observáveis dos músculos do corpo de Drosophila.A imagem confocal demonstrou visualização aprimorada da junção neuromuscular entre o sexto e o sétimo músculos. A microscopia eletrônica de transmissão revelou junções neuromusculares semelhantes a contas, oferecendo informações aprimoradas sobre a estrutura sináptica. As amostras permaneceram planas durante todo o processo de desidratação devido à restrição das malhas metálicas.Além disso, as amostras foram polimerizadas entre os produtos plásticos, evitando que as amostras se dobrassem. No futuro, o método de preparação de amostras MET pode ser aplicado ao neurópilo do cérebro e do cordão nervoso ventral, melhorando assim o potencial da pesquisa ultraestrutural.

Research

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...