Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China Grant 32070811 y el Fondo de Pruebas de Análisis de la Universidad del Sureste (China) 11240090971. Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Electrónica y Centro de Análisis Morfológico de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sureste, Nanjing, China.

NOTA: El método de preparación de muestras de microscopía electrónica de transmisión utilizado en este artículo ha sido reportado anteriormente16. Es importante tener en cuenta que la selección de reactivos y el ajuste de la dosis son necesarios en función de la muestra. Hay muchos reactivos químicos tóxicos utilizados en el proceso de preparación de muestras, por lo tanto, el operador debe tomar ciertas medidas de protección, como usar ropa y guantes protectores y operar en una campan...

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E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

Las muestras de larvas de Drosophila tienden a enroscarse durante la deshidratación, ya que las muestras son delgadas, lo que dificulta la localización precisa de la unión neuromuscular, lo que aumenta la dificultad y la carga de trabajo para la preparación de la muestra. La mejora tradicional consiste en acortar la muestra7, pero las muestras seguían estando curvadas en diferentes grados.
En nuestro método, hay dos pasos críticos: primero, las muestras ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

La microscopía electrónica es uno de los métodos más idóneos para estudiar la ultraestructura de materiales biológicos que puede demostrar de forma visual y precisa la estructura interna de las células a nivel nanométrico1. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de preparación de muestras y al alto costo, la microscopía electrónica no es tan popular como la microscopía óptica. Los avances recientes en las técnicas de microscopía electrónica han dado lugar a mejoras significativas en la calidad de las imágenes, coincidiendo con una notable reducción de la carga de trabajo asociada. En consecuencia, la microscopía electrónica ha asumido un papel importante en el avance del conocimiento científico en diversos campos2.
Drosophila es un excelente modelo animal para realizar manipulaciones genéticas con el fin de controlar con precisión la expresión espacial y temporal de los genes diana3. Además, Drosophila tiene las ventajas de un período de crecimiento corto y una crianza fácil en comparación con los modelos de mamíferos; por lo tanto, Drosophila es ampliamente utilizada en la investigación de morfología 4,5.
En las larvas de Drosophila, los botones de la unión neuromuscular (NMJ) están ampliamente distribuidos en los músculos 6,7, y la inmunotinción de NMJ puede proporcionar fácilmente información sobre la cantidad y morfología de la sinapsis 8,9 . Los botones NMJ ubicados en los músculos6º/7º de los segmentos A2 y A3 son muy adecuados para la investigación cuantitativa y morfológica mediante microscopía óptica. Esto se debe a su tamaño y abundancia10,11. Por lo tanto, las larvas de Drosophila NMJs se consideran un modelo útil para la investigación en neurociencia12.
Sin embargo, es un desafío observar la ultraestructura del bautista NMJ por el TEM. Dado que la ventana de barrido de la microscopía electrónica de transmisión es estrecha, es difícil posicionar los botones NMJ13 ampliamente distribuidos. La otra razón es que la pared corporal de Drosophila es susceptible de enroscarse durante la etapa de deshidratación alcohólica del protocolo de preparación de muestras7.
Los estudios tradicionales han escogido generalmente botones entre los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 como material de muestra debido a su abundancia y tamaño14,15. Los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 son más grandes que los otros músculos y contienen más botones. Sin embargo, cuando las muestras se prepararon para microscopía electrónica, las muestras fijas tendían a volverse delgadas y propensas a curvarse, lo que conducía a un posicionamiento incorrecto de los músculos6º y7º de los segmentos A2 y A3.
Presentamos un nuevo procedimiento de procesamiento que es más efectivo para prevenir el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional de preparación de muestras 7,16, al permitir que las muestras permanezcan planas durante la deshidratación posterior, lo que facilita un mejor posicionamiento de las uniones neuromusculares de las larvas de Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se ha convertido en un valioso sistema modelo en el campo de la neurociencia. La aplicación de la microscopía confocal en el NMJ de Drosophila permite a los investigadores adquirir información sináptica, que abarca tanto datos cuantitativos sobre la abundancia de sinapsis como información detallada sobre su morfología. Sin embargo, la distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis ultraestructural. Este estudio presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. El procedimiento comienza colocando una malla metálica en la base de una botella de fondo plano o tubo de ensayo, seguido de la colocación de muestras de larvas fijas en la malla. Se coloca una malla adicional sobre las muestras, asegurando que estén colocadas entre las dos mallas. Las muestras fijas se deshidratan completamente y se infiltran antes de continuar con el procedimiento de incrustación. Luego, la incrustación de las muestras en resina epoxi se realiza en forma de lámina plana, lo que permite la preparación de los músculos para el posicionamiento y la sección. Beneficiándose de estos pasos, todos los músculos de las larvas de Drosophila pueden visualizarse bajo microscopía óptica, lo que facilita su posterior posicionamiento y seccionamiento. El exceso de resina se elimina después de localizar los músculos6º y7º de los segmentos corporalesA2 yA3. Se realiza un corte ultrafino en serie del6º o7º músculo.

La pared del cuerpo de la larva de Drosophila está compuesta por 30 fibras musculares identificables dispuestas en un patrón regular y se ve como una rebanada delgada después de la disección y fijación21 (Figura 1A). La muestra permanece plana durante el proceso de deshidratación debido a la presencia de las mallas metálicas (Figura 1B, C). El músculo del cuerpo de la larva se entierra en una placa delgad...

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Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .

Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

La distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis de infraestructura. Este protocolo presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. Este método avanzado de preparación de muestras TEM es más eficaz para evitar el curvamiento de las muestras en comparación con el método tradicional, ya que permite que las muestras permanezcan planas durante la deshidratación posterior.La selección de reactivos y el ajuste de la dosis deben ser necesarios en función del tipo de muestra. Hay muchos reactivos químicos tóxicos utilizados en el proceso de preparación de muestras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sheng Qingyuan, un estudiante de maestría del laboratorio del Dr. Gan Guangming.Para comenzar, diseccione las larvas de Drosophila del tercer estadio tardío errantes en solución de Jan y obtenga toda la pared del cuerpo según los procedimientos estándar. Fije la pared del cuerpo de la larva con el fijador en la cámara de disección durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera la pared del cuerpo de la larva de la cámara de disección a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y enjuáguelo varias veces con tampón de cacodilato de sodio.Fije la pared del cuerpo de la larva en tetróxido de osmio al 1% durante dos horas. Después de la fijación, lavar las muestras varias veces con agua destilada. Agregue una solución de acetato urinario saturado al 2% en el tubo para teñir la unión neuromuscular PHI.Y después de dos horas, enjuague las muestras con agua desionizada. A continuación, con unas tijeras, corte dos piezas redondas de malla metálica de un tamaño de poro de 270 micras. Coloca la malla metálica en la base de una botella de fondo plano.Luego coloque las larvas fijadas en la malla, seguido de la colocación de otra malla. Deshidratar las muestras en una concentración creciente de etanol durante 20 minutos cada una a cuatro grados centígrados. A continuación, enjuague las muestras dos veces con óxido de propileno a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una.A continuación, coloque las muestras en una solución de óxido de propileno y resina epoxi, seguida de resina epoxi pura durante dos horas a temperatura ambiente. Para incrustar, corte una película de polietileno en un cuadrado grande y un soporte rectangular pequeño y hueco. Pega el cuadrado pequeño con el cuadrado grande.Agrega suficiente resina epoxi en el centro del cuadrado grande. A continuación, encienda el estereoscopio y coloque las muestras en la resina epoxi precolocada con el lado del músculo hacia arriba. Agregue varias gotas de resina epoxi sobre las muestras y cúbralas con una película de polietileno.Coloque las muestras para la polimerización a temperaturas crecientes durante 24 horas cada una. Después de la polimerización, con una cuchilla afilada, retire las partes sobrantes del cuerpo larvario mientras conserva un trapecio, incluidos los segmentos A2 y A3. Retire el trapecio de la pared del cuerpo larvario restante y fíjelo a la cápsula llena de resina con pegamento AB.Bajo un microscopio óptico, confirme la posición de los músculos sexto y séptimo de los segmentos A2 y A3, manteniendo el plano tangente paralelo al sexto músculo. A continuación, corte una quinta parte de la muestra a lo largo de los dos lados del segmento A3. Con un micrótomo, prepare una sección ultrafina de la muestra a partir del sexto músculo.Después de seccionar, fije tantas rodajas como sea posible a cada malla de cobre. Utilice un microscopio electrónico de transmisión para observar las muestras. Entre la resina Lowicryl K4M y la resina epoxi, la resina Lowicryl K4M proporcionó resultados más nítidos y fácilmente observables de los músculos corporales de Drosophila.Las imágenes confocales demostraron una mejor visualización de la unión neuromuscular entre el sexto y el séptimo músculo. La microscopía electrónica de transmisión reveló uniones neuromusculares en forma de perlas, lo que ofrece una mejor información sobre la estructura sináptica. Las muestras permanecieron planas durante todo el proceso de deshidratación debido a la restricción de las mallas metálicas.Además, las muestras se polimerizaron entre los productos plásticos, evitando que las muestras se doblaran. En el futuro, el método de preparación de muestras TEM se puede aplicar al neuropilo del cerebro y del cordón nervioso ventral, mejorando así el potencial de la investigación ultraestructural.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

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Investigación

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Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...