Name: optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation of China Grant 32070811 och Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Vi tackar laboratoriet för elektronmikroskopi och centrum för morfologisk analys, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, Kina.

OBS: Metoden för provberedning med transmissionselektronmikroskopi som används i denna artikel har rapporterats tidigare16. Det är viktigt att notera att valet av reagenser och justeringen av doseringen är nödvändiga beroende på provet. Det finns många giftiga kemiska reagenser som används i provberedningsprocessen, därför måste operatören vidta vissa skyddsåtgärder, såsom att bära skyddskläder och handskar och arbeta i ett dragskåp.
1. Förfara...

<ol>
	<li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+fat+crystal+systems.">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria.">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li><li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy.">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy.">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li><li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).</li><li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin,+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions.">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li><li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).</li><li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila:+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability.">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li><li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons.">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release.">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li><li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions.">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li><li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy.">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).</li><li>Lovri&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS.">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li><li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope.">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li><li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability.">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila.">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li><li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil.">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).</li></ol>

Prover av Drosophila-larver tenderar att krulla ihop sig under uttorkning, eftersom proverna är tunna, vilket gör det svårt att exakt lokalisera den neuromuskulära förbindelsen, vilket ökar svårigheten och arbetsbelastningen för provberedningen. Den traditionella förbättringen är att förkorta provet7, men proverna var fortfarande böjda i olika grad.
I vår metod finns det två kritiska steg: för det första förblir proverna plana under hela uttor...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Elektronmikroskopi är en av de mest idealiska metoderna för att studera ultrastrukturen hos biologiska material som visuellt och exakt kan påvisa den inre strukturen hos celler på nanonivå1. Men på grund av komplexiteten i provberedningsprocessen och den höga kostnaden är elektronmikroskopi inte lika populär som ljusmikroskopi. De senaste framstegen inom elektronmikroskopiteknik har lett till betydande förbättringar av bildkvaliteten, vilket sammanfaller med en anmärkningsvärd minskning av den tillhörande arbetsbelastningen. Följaktligen har elektronmikroskopi antagit en viktig roll för att främja vetenskaplig kunskap inom olika områden2.
Drosophila är en utmärkt djurmodell för att utföra genetiska manipulationer för att exakt kontrollera det rumsliga och tidsmässiga uttrycket av målgener3. Dessutom har Drosophila fördelarna med en kort tillväxtperiod och enkel uppfödning jämfört med däggdjursmodeller; därför används Drosophila i stor utsträckning inom morfologisk forskning 4,5.
Hos Drosophila-larver är neuromuscular junction (NMJ) boutoner utbredda i musklerna 6,7, och immunfärgning av NMJ kan enkelt ge information om synapsmängd och morfologi 8,9 . NMJ-boutonerna som ligger i 6:e/7:e musklerna i A2- och A3-segmenten är väl lämpade för kvantitativ och morfologisk forskning med hjälp av ljusmikroskopi. Detta beror på deras storlek och överflöd10,11. Därför anses Drosophila-larver NMJ vara en användbar modell för neurovetenskaplig forskning12.
Det är dock utmanande att observera NMJ bouton ultrastruktur med TEM. Eftersom skanningsfönstret för transmissionselektronmikroskopi är smalt är det svårt att placera de brett distribuerade NMJ-boutonerna13. Den andra anledningen är att Drosophilas kroppsvägg är känslig för krullning under alkoholuttorkningssteget i provberedningsprotokollet7.
Traditionella studier har vanligtvis valt boutoner mellan den 6:e och 7:e muskeln i A2 och A3 segmenten som provmaterial på grund av deras förekomst och storlek14,15. Den 6:e och 7:e muskeln iA2- och A3-segmenten är större än de andra musklerna och innehåller fler boutoner. Men när prover förbereddes för elektronmikroskopi tenderade fasta prover att bli tunna och benägna att krulla, vilket ledde till felaktig positionering av de 6:e och 7:e musklerna i A2 och A3-segmenten.
Vi rapporterar härmed en ny bearbetningsprocedur som är mer effektiv för att förhindra curling av proverna jämfört med den traditionella metoden för provberedning 7,16, genom att låta proverna förbli platta under den efterföljande uttorkningen, vilket underlättar bättre positionering av Drosophila-larvens neuromuskulära korsningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Epoxypropane</td>
			<td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td>
			<td>JYJ 037-2015</td>
			<td>Penetrating Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>none</td>
			<td>The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M cross-linker</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Cat# 1924B</td>
			<td>The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4M resin (monomer B)</td>
			<td>&#160;Agar Scientific</td>
			<td>Lot# 631557</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl film</td>
			<td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&#160;</td>
			<td>none</td>
			<td>Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Chem DDSA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02827-AF</td>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem DMP-30 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02823-DA</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Chem NMA</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SpI#02828-AF</td>
			<td>Hardner for Epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-PON 812 Epoxy</td>
			<td>SPI</td>
			<td>SPI#0259-AB</td>
			<td>Resin Monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel mesh&#160;</td>
			<td>Yuhuiyuan Gardening Store(online)</td>
			<td>none</td>
			<td>Copper or stainless steel net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi H-7650</td>
			<td>11416692</td>
			<td>All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin microtome</td>
			<td>Leica UC7 ultrathin microtome</td>
			<td>595915</td>
			<td>All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing sample preparation process for transmission electron microscopy of neuromuscular junctions in drosophila larvae

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) har vuxit fram som ett värdefullt modellsystem inom neurovetenskapen. Tillämpningen av konfokalmikroskopi vid Drosophila NMJ gör det möjligt för forskare att få synaptisk information, som omfattar både kvantitativa data om synapsförekomst och detaljerade insikter i deras morfologi. Den diffusa fördelningen och det begränsade visuella omfånget hos TEM utgör dock utmaningar för den ultrastrukturella analysen. Denna studie introducerar en innovativ och effektiv provberedningsmetod som överträffar det konventionella tillvägagångssättet. Proceduren börjar med att placera ett metallnät i botten av en flatbottnad flaska eller provrör, följt av att placera fasta larvprover på nätet. Ett extra nät placeras över proverna, vilket säkerställer att de är placerade mellan de två maskorna. De fasta proverna dehydreras och infiltreras noggrant innan du fortsätter med inbäddningsproceduren. Sedan utförs inbäddning av proverna i epoxiharts på ett platt arksätt, vilket gör det möjligt att förbereda muskler för positionering och sektionering. Genom att dra nytta av dessa steg kan alla muskler hos Drosophila-larver visualiseras under ljusmikroskopi, vilket underlättar efterföljande positionering och snittning. Överskott av harts avlägsnas efter lokalisering av de 6:e och 7:e musklerna i kroppssegmentenA2 och A3. Seriell ultratunn snittning av den 6:e eller 7:e muskeln utförs.

Drosophila-larvens kroppsvägg består av 30 identifierbara muskelfibrer arrangerade i ett regelbundet mönster och ser ut som en tunn skiva efter dissektion och fixering21 (Figur 1A). Provet förblir plant under uttorkningsprocessen på grund av närvaron av metallmaskorna (figur 1B, C). Larvkroppens muskel är begravd i en tunn platta gjord av epoxiharts (Figur 1D-G</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae at JoVE.com

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Denna rapport ger en ny provberedningsprocedur för att visualisera neuromuskulära korsningar hos Drosophila-larver . Denna metod är mer effektiv för att förhindra curling av proverna jämfört med den traditionella metoden och är särskilt användbar för ultrastrukturell analys av Drosophila neuromuscular junction.

Optimering av provberedningsprocessen för transmissionselektronmikroskopi av neuromuskulära korsningar i Drosophila-larver

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Den diffusa utbredningen och det begränsade visuella området för tvärgående teknik utgör utmaningar för den infrastrukturella analysen. Detta protokoll presenterar en innovativ och effektiv provberedningsmetod som överträffar det konventionella tillvägagångssättet. Denna avancerade metod för TEM-provberedning är mer effektiv för att förhindra curling av proverna jämfört med den traditionella metoden genom att låta proverna förbli platta under den efterföljande uttorkningen.Val av reagens och justering av doseringen måste vara nödvändig beroende på provtyp. Det finns många giftiga kemiska reagenser som används i provberedningsprocessen. En av dem som demonstrerar proceduren är Sheng Qingyuan, en masterstudent från Dr.Gan Guangmings laboratorium.Till att börja med, dissekera de vandrande sena tredje instar Drosophila-larverna i Jan-lösning och få hela kroppsväggen enligt standardprocedurerna. Fixera larvens kroppsvägg med fixeringsmedlet i dissektionskammaren över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag överför du larvens kroppsvägg från dissektionskammaren till ett 1,5 milliliters centrifugrör och sköljer det flera gånger med natriumkakodylatbuffert.Fixera larvkroppens vägg i 1%osmiumtetroxid i två timmar. Efter fixering, tvätta proverna flera gånger med destillerat vatten. Tillsätt 2 % mättad urinal acetatlösning i röret för att färga den neuromuskulära PHI-förbindelsen.Och efter två timmar, skölj proverna med avjoniserat vatten. Använd sedan en sax för att klippa två runda bitar av metallnät med porstorlek 270 mikron. Placera metallnätet i botten av en flaska med platt botten.Placera sedan de fixerade larverna på nätet, följt av att placera ett annat nät. Torka proverna i en ökande etanolkoncentration i 20 minuter vardera vid fyra grader Celsius. Skölj sedan proverna två gånger med propylenoxid i rumstemperatur i fem minuter vardera.Placera sedan proverna i en lösning av propylenoxid och epoxiharts, följt av rent epoxiharts i två timmar vid rumstemperatur. För inbäddning, skär en polyetenfilm i en stor fyrkant och ett litet, ihåligt rektangulärt stöd. Limma fast den lilla fyrkanten med den stora fyrkanten.Tillsätt tillräckligt med epoxiharts i mitten av den stora kvadraten. Slå sedan på stereoskopet och placera proverna i det förpositionerade epoxihartset med muskelsidan uppåt. Tillsätt flera droppar epoxiharts på proverna och täck dem med polyetenfilm.Placera proverna för polymerisation vid ökande temperaturer i 24 timmar vardera. Efter polymerisation, med hjälp av ett vasst blad, ta bort de överflödiga delarna av larvkroppen samtidigt som du behåller en trapets, inklusive A2- och A3-segmentet. Ta bort trapetsen från den återstående larvkroppsväggen och fäst den på den hartsfyllda kapseln med AB-lim.Bekräfta positionen för den sjätte och sjunde muskeln i A2- och A3-segmenten under ett ljusmikroskop, med bibehållande av tangentplanet parallellt med den sjätte muskeln. Skär sedan bort en femtedel av provet längs de två sidorna av A3-segmentet. Använd en mikrotom för att förbereda en ultratunn sektion av provet med början från den sjätte muskeln.Efter sektionering, fäst så många skivor som möjligt på varje kopparnät. Använd ett transmissionselektronmikroskop för att observera proverna. Bland Lowicryl K4M-harts och epoxiharts gav Lowicryl K4M-harts skarpare och lättare observerbara resultat av Drosophilas kroppsmuskler.Konfokal avbildning visade förbättrad visualisering av den neuromuskulära förbindelsen mellan den sjätte och sjunde muskeln. Transmissionselektronmikroskopi avslöjade pärlliknande neuromuskulära korsningar, vilket ger förbättrad synaptisk strukturinformation. Proverna förblev plana under hela uttorkningsprocessen på grund av begränsningen av metallmaskorna.Dessutom polymeriserades proverna mellan plastprodukterna, vilket förhindrade att proverna veckade sig. I framtiden kan TEM-provberedningsmetoden tillämpas på neuropil i hjärnan och ventrala nervsträngen och därigenom förbättra potentialen för ultrastrukturell forskning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokuserad jonstråle Fräsning och Svepelektronmikroskopi av hjärnvävnad

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associativ Olfactory Lärande i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Födosök Path längd protokoll för<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Framställning av icke-mänskliga primater hjärnvävnad för Pre-inbäddning Immunohistokemi och elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel analys för Cold Nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Förberedelse för undersökning av däggdjur neuromuskulär Transmission spänningen klämman villkor

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Förberedelse av rått vokalvikten för neuromuskulära analyser

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissekering av enstaka skelettmuskelfibrer för immunofluorescerande och morfometriska analyser av neuromuskulära korsningar på hela berget

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...