Name: development of leishmania species strains with constitutive expression of egfp
Uploaded: 2023-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, bevillingsnummer NI-177-2016, og Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, tilskudsnumre SNI-169-2018, SNI-008-2022 og SNI-060-2022.

For at holde prøverne sterile skal alle trin, der involverer parasitkultur, udføres inde i en hætte til biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) eller i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsbestemmelser. Et grafisk resumé af denne protokol findes i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64939/64939fig01.jpg"> Figur 1: Resumé af protokollen til generering af eGFP-ekspressive L. pa...

<ol>
	<li>Alvar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmaniasis+worldwide+and+global+estimates+of+its+incidence.">Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence.</a> PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).</li><li>Franssen, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genome+diversity+of+the+Leishmania+donovani+complex.">Global genome diversity of the Leishmania donovani complex.</a> eLife. 9, e51243 (2020).</li><li>Salda&#241;a, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+cutaneous+leishmaniasis+rates+are+associated+with+household+Lutzomyia+gomezi,+Lu.+Panamensis,+and+Lu.+trapidoi+abundance+in+Trinidad+de+Las+Minas,+western+Panama.">Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy,+diversity,+temporal+and+geographical+distribution+of+Cutaneous+Leishmaniasis+in+Colombia:+A+retrospective+study.">Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study.</a> Scientific Reports. 6, 28266 (2016).</li><li>Ponte-Sucre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+treatment+failure+in+leishmaniasis:+A+21st+century+challenge.">Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).</li><li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis.">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).</li><li>Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+sensitivity+of+Leishmania+species:+some+unresolved+problems.">Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).</li><li>Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures.">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).</li><li>Don, R., Ioset, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+strategies+to+identify+new+chemical+diversity+for+drug+development+to+treat+kinetoplastid+infections.">Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections.</a> Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).</li><li>Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation+of+Leishmania+infantum+axenic+amastigotes+and+their+use+in+drug+screening.">DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).</li><li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+infections+in+macrophages+and+in+animal+models.">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).</li><li>Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Leishmania+expressing+luciferase+for+rapid+and+high+throughput+screening+of+drugs+acting+on+amastigote-harbouring+macrophages+and+for+quantitative+real-time+monitoring+of+parasitism+features+in+living+mice.">Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).</li><li>Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Leishmania+donovani+field+isolates+expressing+the+luciferase+reporter+gene+in+in+vitro+drug+screening.">Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).</li><li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+amastigotes+grown+in+macrophages.">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).</li><li>Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+recombinant+Leishmania+amazonensis+expressing+egfp+or+the+beta-galactosidase+gene+for+drug+screening+and+histopathological+analysis.">Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis.</a> Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).</li><li>Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+effects+of+antileishmanial+compounds+in+vitro.">Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).</li><li>Singh, N., Dube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+report:+fluorescent+Leishmania:+application+to+anti-leishmanial+drug+testing.">Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).</li><li>Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+to+the+treatment+of+sodium+stibogluconate+in+Indian+kala-azar+field+isolates+persist+in+in+vitro+and+in+vivo+experimental+models.">Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models.</a> Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).</li><li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein.">A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).</li><li>Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+I-mediated+transcription+of+a+reporter+gene+integrated+into+different+loci+of+Leishmania.">RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>Calvo-&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+fluorescent+imaging+as+a+potent+tool+for+in+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+models+of+visceral+leishmaniasis.">Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).</li><li>Garc&#237;a-Bustos, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescent+assay+to+search+new+drugs+using+stable+tdtomato-leishmania,+and+the+selection+of+galangin+as+a+candidate+with+anti-leishmanial+activity.">Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).</li><li>Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Leishmania+donovani+clinical+isolates+expressing+green+fluorescent+protein+constitutively+for+rapid+and+reliable+ex+vivo+drug+screening.">Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).</li><li>De Rycker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+high-throughput+high-content+intracellular+Leishmania+donovani+assay+with+an+axenic+amastigote+assay.">Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).</li><li>Pe&#241;a, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+compound+sets+identified+from+high+throughput+phenotypic+screening+against+three+kinetoplastid+parasites:+an+open+resource.">New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource.</a> Scientific Reports. 5, 8771 (2015).</li><li>Bolhassani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Leishmania+species:+development+of+stable+GFP+expression+and+its+application+for+in+vitro+and+in+vivo+studies.">Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies.</a> Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).</li><li>Breitling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-pathogenic+trypanosomatid+protozoa+as+a+platform+for+protein+research+and+production.">Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production.</a> Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).</li><li>Pulido, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+green+fluorescent+protein+reporter+system+in+Leishmania+spp.+for+the+in+vitro+and+in+vivo+screening+of+antileishmanial+drugs.">Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs.</a> Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).</li><li>Bastos, M. S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achievement+of+constitutive+fluorescent+pLEXSY-egfp+Leishmania+braziliensis+and+its+application+as+an+alternative+method+for+drug+screening+in+vitro.">Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).</li><li>Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEBcutter:+A+program+to+cleave+DNA+with+restriction+enzymes.">NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).</li><li>Santar&#233;m, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+distinct+culture+media+in+Leishmania+infantum+biology+and+infectivity.">The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity.</a> Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).</li><li>Medina-Acosta, E., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+DNA+from+trypanosomatid+protozoa+using+a+simple+&amp;#34;mini-prep&amp;#34;+procedure.">Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple &amp;#34;mini-prep&amp;#34; procedure.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).</li><li>Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+limiting+dilution+method+for+monoclonal+stable+cell+line+selection+using+a+real-time+fluorescence+imaging+system:+a+practical+workflow+and+advanced+applications.">A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications.</a> Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).</li><li>Varela, M. R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+(Viannia)+panamensis:+an+in+vitro+assay+using+the+expression+of+GFP+for+screening+of+antileishmanial+drug.">Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug.</a> Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).</li><li>Komura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+induced+impaired+TLR+signaling+and+macrophage+differentiation+of+human+monocytes.">ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes.</a> Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).</li></ol>

Fordele og ulemper ved forskellige reportergener er blevet undersøgt i flere protozoiske parasitter. Blandt dem er GFP og eGFP iboende fluorescerende og muliggør let kvantificering og billeddannelse. Den fluorescerende aktivitet af disse proteiner kan detekteres med minimal manipulation ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flowcytometri. Der er kun udført få undersøgelser for at generere GFP-ekspressiv L. (Viannia) stammer, på trods af den påviste robusthed af GFP og deres d...

Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis, en sygdom med en bred vifte af kliniske manifestationer. Denne sygdom er udbredt i 98 lande, og dens årlige forekomst anslås til 0,9 til 1,6 millioner tilfælde1. Leishmania-arter, der er patogene for mennesker, er opdelt i to underslægter, nemlig L. (Leishmania) og L. (Viannia). Infektion med nogle arter, der tilhører L. (Leishmania) underslægt, såsom L. donovani og L. infantum, kan resultere i visceral leishmaniasis (VL), som er dødelig, hvis den ikke behandles2. Arter tilhørende L. (Viannia) subgenus er forbundet med de fleste tilfælde af kutan leishmaniasis (CL) og mucokutan leishmaniasis (MCL) i Central- og Sydamerika, især i Panama, Colombia og Costa Rica, hvor L. panamensis er det vigtigste ætiologiske middel til disse kliniske præsentationer 3,4.
Eksisterende anti-leishmania kemoterapi, der omfatter lægemidler som pentavalente antimonials, miltefosin og amphotericin B er meget giftig og dyr. Desuden er øget lægemiddelresistens i de seneste årtier blevet føjet til de faktorer, der forstyrrer effektiv behandling af patienter over hele verden5. Der er påvist betydelige forskelle på tværs af arter af slægten Leishmania i forhold til lægemiddelfølsomhed, især mellem New og Old World arter 6,7. Af disse grunde er det nødvendigt at rette indsatsen mod identifikation og udvikling af nye lægemidler mod leishmani, idet der lægges særlig vægt på artsspecifikke tilgange. Det er ret vanskeligt at studere store biblioteker af lægemiddelkandidater med traditionelle metoder, da disse metoder er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære amastigoter eller til udførelse af in vivo-eksperimenter 8; Derfor har det været nødvendigt at udvikle nye teknikker, der reducerer disse ulemper, herunder implementering af reportergener og udvikling af fænotypiske screeningsassays med højt indhold9.
Brugen af reportergener har vist potentialet til at øge effektiviteten af lægemiddelscreeningsprocessen, da det letter udviklingen af high-throughput og in vivo-assays. Rekombinante Leishmania-parasitter, der udtrykker flere reportergener, er blevet genereret af forskellige forskergrupper. Reportergener, såsom β-galactosidase, β-lactamase og luciferase, er blevet introduceret i flere Leishmania-arter ved hjælp af episomale vektorer, hvilket viser begrænset anvendelighed til lægemiddelscreening i ekstra- og intracellulære former af parasitten 10,11,12,13,14,15. Disse tilgange har begrænsningen ved at kræve et stærkt selektivt tryk i kultur for at undgå eliminering af den episomale konstruktion samt brugen af yderligere reagenser til at afsløre aktiviteten af reportergenet. Omvendt er det grønne fluorescerende protein (GFP) og dets variant, det forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP), blevet anvendt til generering af et stort antal transgene Leishmania-stammer til in vitro-lægemiddelscreeningsassays på grund af deres fleksibilitet og følsomhed samt muligheden for at automatisere screeningsprocessen ved hjælp af flowcytometri eller fluorometri15, 16,17,18,19. På trods af lovende resultater var kulturer af disse transgene stammer meget heterogene i deres fluorescensniveauer, da antallet af kopier af GFP-genet ikke var det samme i alle parasitterne. Desuden krævede opretholdelse af fluorescens konstant selektivt tryk på parasitterne i kultur, da GFP-genet blev introduceret i en episomal konstruktion.
Af de grunde, der er nævnt ovenfor, har mange bestræbelser fokuseret på at udvikle nye metoder til fremstilling af stabile rekombinante stammer. Disse bestræbelser har for det meste været afhængige af integrationen af reportergener i ribosomale loci og udnyttet de højere transkriptionshastigheder for ribosomale gener20. Stammer af L. infantum og L. amazonensis er blevet genereret efter at have integreret generne, der koder for β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 og tdTomato23, og de er blevet evalueret for deres anvendelighed i lægemiddelscreeningsassays. Forskellige grupper har udviklet L. donovani-stammer, der udtrykker GFP konstitutivt ved at integrere dets kodende gen i 18S ribosomalt RNA-locus (ssu locus) gennem homolog rekombination24,25; de viste stabil og homogen GFP-ekspression i den transfekterede population, herunder intracellulære amastigoter 24,25, og de blev med succes implementeret i lægemiddelscreeningsassays24,25,26. Bolhassani et al.27 udviklede stammer af L. major og L. infantum, der udtrykker GFP som et integreret transgen. De brugte integrationsvektoren pLEXSY, oprindeligt designet til transgen ekspression af proteiner i et system med L. tarentolae som vært28. pLEXSY-GFP-vektoren har vist sig at være meget effektiv til generering af forskellige Leishmania-stammer, der konstitutivt udtrykker GFP 24,25,27,29,30. I disse parasitter er fluorescens homogen og opretholdes i de intracellulære former, idet den kan påvises i fodpudelæsioner af inficerede mus27.
I dette arbejde beskriver vi den metode, der anvendes til generering af L. panamensis - og L. donovani-stammer , der udtrykker genet, der koder for eGFP, som et integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. De stammer, der genereres gennem denne proces, bruges i vores laboratorium til at udføre lægemiddelscreeningsassays, der evaluerer den potentielle anti-leishmania-aktivitet af molekyler af naturlig og syntetisk oprindelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3340</td>
			<td>Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8351</td>
			<td>BioXtra, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII restriction enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td>2,000 units. 10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyFlow Space</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2526</td>
			<td>&#160;The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td>The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>Pkg of 50, 0.2 cm&#8211;gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 &#956;m filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Long PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IXplore Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3142S</td>
			<td>4,000 units. 20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular&#160;E.coli&#160;culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2542</td>
			<td>Liquid microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1640300</td>
			<td>Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1-1x</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>172281</td>
			<td>Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLEXSYcon2.1 expression kit</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>EGE-1310sat</td>
			<td>Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529552</td>
			<td>Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td>Up to 15 &#956;g of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8242;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td>Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, &#8805;99% (titration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD038</td>
			<td>BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, &#8805;99.0%, free-flowing, Redi-Dri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SwaI restriction enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0604S</td>
			<td>2,000 units. 10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431212</td>
			<td>regenerated cellulose membrane, diam. 4&#160;mm, pore size 0.2&#160;&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td>Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td>BioReagent, suitable for electrophoresis, 10&#215; concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200317</td>
			<td>XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F&#39; episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: &#62; 5 x 10 9 transformants/&#181;g pUC18 DNA.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of leishmania species strains with constitutive expression of egfp

Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis , en sygdom med variable kliniske manifestationer, der rammer millioner af mennesker over hele verden. Infektion med L. donovani kan resultere i dødelig visceral sygdom. I Panama, Colombia og Costa Rica er L. panamensis ansvarlig for de fleste af de rapporterede tilfælde af kutan og mucokutan leishmaniasis. At studere et stort antal lægemiddelkandidater med de metoder, der er tilgængelige til dato, er ret vanskeligt, da de er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære former af parasitten eller til udførelse af in vivo-assays . I dette arbejde beskriver vi dannelsen af L. panamensis - og L. donovani-stammer med konstitutiv ekspression af genet, der koder for et forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) integreret i locus, der koder for 18S rRNA (ssu). Genet, der koder for eGFP, blev opnået fra en kommerciel vektor og amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) for at berige det og tilføje restriktionssteder for BglII- og KpnI-enzymerne. eGFP-amplikonen blev isoleret ved agarosegelrensning, fordøjet med enzymerne BglII og KpnI og ligeret i Leishmania-ekspressionsvektoren pLEXSY-sat2.1, der tidligere var fordøjet med det samme sæt enzymer. Ekspressionsvektoren med det klonede gen blev formeret i E. coli, renset, og tilstedeværelsen af indsatsen blev verificeret ved koloni PCR. Det rensede plasmid blev lineæriseret og brugt til at transfektere L. donovani og L . panamensis parasitter. Integrationen af genet blev verificeret ved PCR. Ekspressionen af eGFP-genet blev evalueret ved flowcytometri. Fluorescerende parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet blev valgt ved anvendelse af flowcytometri.

Efter opbygning af pLEXSY-eGFP-konstruktionen og transformering af kompetente E. coli-celler vil kolonier, der indeholder konstruktionen med eGFP-indsatsen, generere et produkt på ca. 859 bp efter kørsel af koloni-PCR beskrevet i afsnit 1.2 (figur 3A). Total fordøjelse af det rensede plasmid fra positive kolonier ved anvendelse af SwaI bør give to karakteristiske fragmenter i gelelektroforese, et 2,9 kbp fragment, der er den del af PLEXSY-vektoren, der indeholder alle d...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP at JoVE.com

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Her beskriver vi den metode, der anvendes til at generere L. panamensis - og L. donovani-stammer , der udtrykker genet for eGFP som et stabilt integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. Transfekterede parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet i begge arter blev udvalgt til videre brug i lægemiddelscreeningsanalyser.

Udvikling af Leishmania-artsstammer med konstitutiv ekspression af eGFP

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people ...

Denne protokol er nøglen til generering af stammer, der kan bruges i screeningsanalyser med høj kapacitet til at evaluere molekylernes potentielle og traditionelle aktivitet Demonstration af proceduren vil være Juana Quintero og Laura Pineda, forskningsassistenter fra mit laboratorium. Til at begynde med skal du forstærke målgenet ved hjælp af en high fidelity-polymerase for at bevare kodningssekvensen. Tilsæt primerne til reaktionsblandingen i en slutkoncentration på 0,2 mikromolær og kør en PCR-cykelprotokol som beskrevet i manuskriptet.Rens det forstærkede PCR-fragment ved hjælp af et konventionelt PCR-produktrensningssæt. For at trimme enderne af eGFP PCR-produktet skal du oprette en reaktion med Kpn I-enzym i henhold til producentens anvisninger og inkubere ved 37 grader Celsius i en time. Derefter tilsættes 100 millimolar natriumchlorid og 10 enheder Bgl II til reaktionen og inkuberes i 15 minutter.Efter fordøjelsen renses reaktionen som vist tidligere. Derefter fordøjes pLEXSY-ekspressionsvektor med Bgl II og Kpl I efter den sekventielle fordøjelse som vist tidligere. Ligate 100 nanogram fordøjet pLEXSY-vektor og 28 nanogram fordøjet eGFP i en 20 mikroliter reaktion indeholdende ligasebuffer og tre enheder T4 DNA-ligase.Inkuber natten over ved fire grader Celsius. Ved afslutningen af inkubationen transformeres kompetente Escherichia coli-celler med ligeringsproduktet ved hjælp af standardtransformationsprotokoller. Plade de transformerede celler i LB ampicillin agar og inkuber i 24 timer ved 30 grader Celsius for at vælge rekombinante kloner.Efter screening af kolonierne renses plasmid-DNA fra en positiv klon til efterfølgende transfektion ved hjælp af et kommercielt plasmidisoleringssæt. For at producere lineære fragmenter af plasmidet skal du tage mindst 10 mikrogram af det rensede pLEXSY eGFP-plasmid og fordøje det med SWA1 i tre til fire timer ved 25 grader Celsius. Ved afslutningen af inkubationen inaktiverer varmen fordøjelsesproduktet ved 65 grader Celsius i 20 minutter.Kør derefter fordøjelsesproduktet i agarosegelelektroforese for at adskille de resulterende fragmenter. Rens ekspressionskassetten ved hjælp af et kommercielt agarosegelekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger. Vok parasitkulturerne, indtil der er nok logfase eller tidlige stationære fase promastigoter.Saml indholdet af flere kulturkolber, hvis det er nødvendigt. Centrifuger parasitkulturen ved 2.000 G i tre minutter ved stuetemperatur. Resuspender pellet i elektroporationsbuffer ved fire grader Celsius for at få en koncentration på en gange 10 til den ottende parasitter pr. Milliliter og hold den på is i 10 minutter.Samtidig konstrueres forkølerør med 2 til 10 mikrogram lineær pLEXSY eGFP i 50 mikroliter vand eller 10 millimolær trisbuffer med pH 8,0 og elektroporationskuvetter med en diameter på to millimeter. Derefter tilsættes 350 mikroliter forkølede parasitter til røret med det lineariserede plasmid og overfører hele 400 mikroliter til elektroporationskuvetten på is. Elektroporat parasitcellerne med plasmid og parallelt parasitceller uden plasmid-DNA som negativ kontrol.Sæt kuvetten på is i 10 minutter. Overfør de elektroporerede parasitter til fem ml af det passende dyrkningsmedium og inkuber ved 26 grader Celsius i 20 timer. Ca. 20 timer efter elektroporation observeres kulturerne under et mikroskop og tilsættes det passende selektive antibiotikum afhængigt af det anvendte pLEXSY-plasmid.Følg kulturerne mikroskopisk, indtil der er en klar forskel mellem parasitter elektroporeret med og uden plasmid-DNA. For at verificere parasitfluorescens gennem flowcytometri centrifugeres en milliliter af den stationære fasekultur ved 2.000 G i tre minutter ved stuetemperatur. Efter vask af cellerne to gange i PBS resuspenderes den endelige pellet i en milliliter PBS.Kør prøver og saml 20.000 begivenheder med en hastighed på 0, 5 mikroliter pr. Sekund. Angiv forstærkningsværdier for fremadrettet spredning, sidespredning og fluorescens en-kanaler som henholdsvis 225,0, 200,0 og 520,0. Opret en port G1, der indeholder parasitpopulationen.Filtrer FL1-kanalen gennem denne port for at bestemme promastigoternes autofluorescens, og indstil en rækkeviddeport G2 for FL1-kanalen. Kør de transfekterede parasitter for at kontrollere, om der er fluorescens. Registrer procentdelen af parasitter i G1, der er fluorescerende, og gennemsnittet af fluorescensintensiteten i G2. Rens genomisk DNA fra to til fem ml af en stationær fase parasitkultur ved konventionel phenolchloroformekstraktion eller med et kommercielt kit.Udfør diagnostisk PCR for pLEXSY-sat2.1 ved hjælp af en cykelprotokol som beskrevet i manuskriptet. Efter bekræftelse af fluorescens gennem flowcytometri fremstilles en fortynding af rekombinante parasitter i en koncentration på fem promastigoter pr. Milliliter. Tilsæt 100 mikroliter af denne fortynding i hvert hul på en 96-brøndplade, og lad pladen stå uforstyrret i mindst 12 timer.Pladen følges mikroskopisk ved en minimumsforstørrelse på 100X, indtil brønde med parasitvækst detekteres. Når en brønd er fuld af parasitter, skal du bruge indholdet til at inokulere en fem milliliter kultur. Når de klonfrøede kulturer når den stationære fase, skal du kontrollere fluorescens ved hjælp af flowcytometri som beskrevet tidligere.Vælg kloner med 98% til 99% fluorescerende parasitter og den højeste gennemsnitlige fluorescensintensitet for in vitro og in vivo assays. Koloni-PCR af E. coli-cellerne transformeret med pLEXSY eGFP-konstruktion genererede et 859 baseparprodukt. Total fordøjelse af plasmidet ved anvendelse af SWA1 resulterede i to fragmenter, et 2,9 kilobaseparfragment indeholdende alle de nødvendige elementer til replikation og udvælgelse i E. coli og et syv til otte kilobaseparfragment, der repræsenterer den lineariserede ekspressionskassette, der anvendes til transfektion.Flowcytometrianalyse afslørede, at 82% af de transfekterede L.panamensis-parasitter udtrykte eGFP. Efter polyklonal selektion var 98,44% af L.donovani-parasitter analyseret ved flowcytometri fluorescerende sammenlignet med 82,0% af L.panamensis. Den vellykkede integration af pLEXSY eGFP i SSU-locus resulterede i et 2,3 kilobaseparprodukt i den diagnostiske PCR.Kloner med den højeste procentdel af fluorescerende parasitter og gennemsnitlig fluorescensintensitet blev udvalgt til videre brug i lægemiddelscreeningsanalyser. Denne metode tillader produktion af rekombinante Leishmania parasitter med

Research

JoVE Journal

Genetics

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Måling af genekspression i bombarderede Byg Aleurone lag med øget gennemløb

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

En Ecdysone Receptor-baserede ental gen Switch til bevidst udtryk for transgen med robusthed, reversibilitet og ubetydelig Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kortlægning af termo Toleranceforskelle mellem arter af Saccharomyces gær via Genome-Wide gensidig Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...