プロファージは細菌のファージであり、細菌のゲノムに組み込まれています。私たちは、トランスクリプトーム的アプローチを用いて、プロファージが宿主細菌の生物学に及ぼす影響を包括的に研究しています。ここで説明する方法は、プロファージ溶解サイクルの自発的誘導という重要な課題に対処します。
培養条件を慎重に最適化することで、増殖状態における遺伝子発現のクリーンなプロファイリングが可能になります。プロファージはほとんどの細菌性病原体に見られますが、その重要性は通常理解されていません。これらのツールは、複数の細菌機能の調節因子としてのプロファージの役割を明らかにすることができます。
研究されていないプロファージホストの関係はほぼ無限にあります。これは、これらのプロトコルが予測に役立つ潜在的な治療標的の巨大な未開発のリソースを表しています。主な課題は、リゾゲンの増殖と自発的な増殖誘導のバランスをとるための適切な培養条件を見つけることです。
よく知られている二次的な課題であるライソンは、ダウンストリーム研究のためにRNAの完全性を維持します。まず、100ミリリットルのLBを1対100の比率で一晩培養して、新鮮なライソゲンおよび指標宿主培養をセットアップします。摂氏37度でインキュベートし、180RPMで振とうします。
リゾゲンの増殖を監視するには、接種時点から8時間、1時間ごとに1ミリリットルのサンプルを収集します。連続的に、900マイクロリットルのLV培地に100マイクロリットルを加えて培養を希釈します。最高速度でボルテックスし、10からマイナス1、10からマイナス9まで希釈系列を続けます。
必要な希釈液の10マイクロリットルをLBオーガープレートにスポットします。乾燥させ、摂氏30度で18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、コロニーの数を数え、与えられた式を使用して生菌細胞の数を計算します。
次に、側頭サンプル中の感染性ファージ粒子を列挙するために、100マイクロリットルの対数相リファンピシン耐性インジケーター宿主細胞をリファンピシンとともに溶融オーガーに加えます。段階希釈したライソゲン培養液10マイクロリットルを、接種したトップオーガー層にスポットします。乾燥させ、摂氏37度で18〜24時間インキュベートする。
インキュベーション後、プラークの数を数え、与えられた式を使用して感染性ファージ粒子を計算します。最初のフラスコに非誘導のラベルを付け、他のフラスコに誘導のラベルを付け、各サンプルを回収する時点を記載します。次に、8つの250ミリリットルフラスコで1対100の比率で80ミリリットルのLBで一晩培養したライソジェニック培養物を継代培養します。
フラスコを摂氏37度でインキュベートし、180RPMで振とうします。90分後、600ナノメートルでの光学濃度が0.1〜0.2の場合、4マイクロリットルの1%氷酢酸を非誘導フラスコに加えます。非誘導フラスコから80ミリリットルの培養液を720ミリリットルのLBに加え、すぐに160ミリリットルの停止溶液を加えてから、フラスコを氷上に30分間置いてRNA転写産物を安定化させます。
次に、ノルフロキサシンを1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度で、80ミリリットルの培養物を含む誘導標識フラスコに添加する。よく混合し、180RPMで1時間振とうしながら摂氏37度でインキュベートします。720ミリリットルのLBに80ミリリットルの誘導培養を加えて、細胞を回復させます。停止溶液を添加して、ゼロから1時間まで10分ごとに各フラスコから細菌細胞を収穫します。
摂氏4度で15分間10, 000 Gで遠心分離し、上清を廃棄します。調整可能な自動ピペットを使用して、ペレットを残留液に静かに再懸濁する前に。懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、13, 000Gで4°Cで1分間遠心分離します。
残った上清を廃棄し、マイクロチューブを密封してから、ペレットを液体窒素に瞬間凍結します。各凍結ペレットに1ミリリットルのトリゾールを加え、ピペッティングで懸濁液を均質化します。目的のファージの複製の各段階のマーカーとして作用し得る一組の標的遺伝子を同定した後、関連するプライマーを用いてゲノムDNAから標的遺伝子のそれぞれを増幅する。
本文原稿に記載の増幅条件を用いてPCRを行う。PCR後、PCR精製キットを使用して各アンプリコンを精製し、メーカーの指示に従ってTAクローニングベクターでクローニングします。サンガーシーケンシングにより、各クローニング産物の配列を確認します。
4つの個別のプラスミドのコピー数を計算した後、プラスミドDNAをヌクレアーゼフリー水で段階希釈することにより、各マーカー遺伝子の標準テンプレートを調製します。1マイクロリットルのCDNAとそれぞれのプラスミド標準試料を、96ウェルプレートの各ターゲットに添加します。そして、メーカーの指示に従って定量PCRを行います。
PCR後、Excelプログラムを使用して、ログDNAコピー数とサイクルしきい値をプロットします。線形回帰計算を実行して、決定係数と線形方程式を表示します。次に、線形回帰から導出された線形方程式を使用して、各ターゲットのコピー数を推定します。
次に、検量線の線形回帰と所定の式からのパラメータを使用して、PCR増幅の有効性を計算します。プライマーの効率をパーセントで検証した後、DNAの絶対コピー数を計算します。自発的なプロファージ産生の少なさを時間的に列挙したところ、2時間後には細胞当たりのPFU数が最も低く、6時間後には細胞当たりのPFU数が最も高かった。
その後、リゾジェンは2時間で最も安定していました。したがって、この条件はQRTPCRプロファイリングに使用されました。溶解性複製の初期マーカーであるcro遺伝子の発現が、非誘導培養では10倍から9コピー目まで、誘導後30分後には10倍から11コピー目まで3.02倍に顕著に増加した。
同様に、溶解複製の中期マーカーであるPタンパク質とOタンパク質も、10コピー目が1.74倍から8枚目、10枚目が1.25倍、10枚目が10倍6.05倍、5枚目が10倍5枚目まで、それぞれ有意なアップレギュレーションを示しました。溶解性複製サイクルの後期マーカーは、誘導後30分まで非誘導培養での発現の有意な増加を示しました。試験した内部コントロールの中で、RPODは16のSRNAまたはProC遺伝子と比較して最も安定した発現を示しました。
溶解性複製のマーカーと比較して、C-one遺伝子の発現は比較的安定していました。それでも、C-one遺伝子のコピー数は、溶解性複製のマーカーと比較して、非誘導培養で安心できるほど高かった。準備が不十分なRNAライブラリーからは、良いデータや解釈は得られません。
自発的誘導とRNAの完全性を制御することが最も重要なことです。あらゆる遺伝子の時間的動態は、発現プロファイリングを用いて研究することができます。適切な実験条件と時間ポイントを調整することは、あらゆる刺激に対する生物学的応答を正しくマッピングするために重要です。
この手法により、2つの異なるプロファージホストパートナーシップ間のこれまで知られていなかった相互作用が特定されました。ほとんどの細菌は未研究のプロファージを収容しているため、このアプローチは多くの新しい治療標的や用途の発見に役立つ可能性があります。
