프로파지는 박테리아 게놈에 통합된 박테리아 파지입니다. 우리는 프로파지가 박테리아 숙주의 생물학에 미치는 영향을 포괄적으로 탐구하기 위해 전사체 접근법을 사용하고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 프로파지 용해 주기의 자발적 유도라는 주요 과제를 해결합니다.
배양 조건의 신중한 최적화를 통해 프로파지 상태에서 유전자 발현을 깔끔하게 프로파일링할 수 있습니다. 프로파지는 대부분의 박테리아 병원체에서 발견되지만 그 중요성은 일반적으로 이해되지 않습니다. 이러한 도구는 여러 박테리아 기능의 조절자로서 프로파지의 역할을 조명할 수 있습니다.
아직 연구되지 않은 프로파지 숙주 관계는 거의 무한합니다. 이는 이러한 프로토콜이 예측하는 데 도움이 될 수 있는 잠재적인 치료 표적의 거대한 미개발 자원을 나타냅니다. 주요 과제는 라이소겐 성장과 자발적인 프로파지 유도의 균형을 맞추기 위해 올바른 배양 조건을 찾는 것입니다.
잘 알려진 2차 과제인 lyson은 다운스트림 연구를 위한 RNA 무결성을 유지합니다. 100 밀리리터의 LB를 1:100의 비율로 접종하여 신선한 라이소겐 및 지표 숙주 배양을 시작합니다. 섭씨 37도에서 180RPM으로 흔들어 배양합니다.
라이소겐 성장을 모니터링하려면 접종 시점부터 8시간 동안 매시간 1밀리리터 샘플을 수집합니다. 직렬로, LV 배지의 900 마이크로 리터에 100 마이크로 리터를 첨가하여 배양을 희석합니다. 최대 속도로 소용돌이치고 10에서 마이너스 1, 10에서 마이너스 9로 희석 시리즈를 계속합니다.
필요한 희석액 10마이크로리터를 LB 오거 플레이트에 묻힙니다. 건조시키고 섭씨 30도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 배양 후 콜로니의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 생존 가능한 박테리아 세포의 수를 계산합니다.
다음으로, 측두엽 샘플에서 감염성 파지 입자를 열거하기 위해 리팜피신과 함께 100마이크로리터의 로그 상 리팜피신 내성 지표 숙주 세포를 용융된 상단 오거에 추가합니다. 연속적으로 희석된 10마이크로리터의 라이소겐 배양액을 접종된 상단 오거 층에 스포팅합니다. 건조시키고 섭씨 37도에서 18-24시간 동안 배양합니다.
배양 후 플라크의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 감염성 파지 입자를 계산합니다. 첫 번째 플라스크는 유도되지 않음으로, 다른 플라스크는 유도됨으로 라벨을 붙이고 각 샘플을 채취해야 하는 시점을 표시합니다. 그런 다음 8개의 250밀리리터 플라스크에서 1 대 100의 비율로 80밀리리터의 LB에서 하룻밤 동안 성장한 용원 배양물을 하위 배양합니다.
플라스크를 섭씨 37도에서 180RPM으로 흔들어 배양합니다. 90분 후 600나노미터의 광학 밀도가 0.1에서 0.2 사이일 때 유도되지 않은 플라스크에 4마이크로리터의 1% 빙초산을 추가합니다. 유도되지 않은 플라스크에서 80 밀리리터 배양액을 720 밀리리터의 LB에 첨가하고 즉시 160 밀리리터의 정지 용액을 첨가한 후 플라스크를 30분 동안 얼음 위에 두어 RNA 전사체를 안정화시킵니다.
다음으로, 80 밀리리터의 배양액을 함유 한 유도 라벨 플라스크에 밀리리터당 1 마이크로그램의 최종 농도로 노르플록사신을 첨가합니다. 잘 섞고 섭씨 37도에서 180RPM으로 1시간 동안 흔들어 배양합니다. 720 밀리리터의 LB에 80 밀리리터의 유도 배양액을 첨가하여 세포가 회복되도록 합니다. 정지 용액을 추가하여 0분에서 1시간까지 10분마다 각 플라스크에서 박테리아 세포를 수확합니다.
4 섭씨 온도에 15 분 동안 10, 000 G에 분리기 및 상층액을 폐기하십시오. 조정 가능한 자동 피펫을 사용하여 잔류 액체에 펠릿을 부드럽게 다시 부유시키기 전에. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 관에 현탁액을 옮기고 13에 원심분리기, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 G.
잔류 상층액을 버리고 펠릿을 액체 질소로 급속 동결하기 전에 미세분리기 튜브를 밀봉합니다. 각 냉동 펠릿에 1mL의 Trizol을 추가하고 피펫팅으로 현탁액을 균질화합니다. 관심 파지의 각 복제 단계에서 마커 역할을 할 수 있는 표적 유전자 세트를 식별한 후 관련 프라이머를 사용하여 게놈 DNA에서 각 표적 유전자를 증폭합니다.
텍스트 원고에 기술된 증폭 조건을 사용하여 PCR을 수행합니다. PCR 후 PCR 정제 키트를 사용하여 각 앰플리콘을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 TA 클로닝 벡터에서 클로닝합니다. Sanger 염기서열분석을 통해 각 복제된 산물의 염기서열을 확인합니다.
4개의 개별 플라스미드의 복제 수를 계산한 후, 플라스미드 DNA를 뉴클레아제 유리수에 연속적으로 희석하여 각 마커 유전자에 대한 표준 템플릿을 준비합니다. 각 타겟에 대해 1마이크로리터의 CDNA와 각 플라스미드 표준물질을 96웰 플레이트에 추가합니다. 그리고 제조업체의 지침에 따라 정량적 PCR을 수행합니다.
PCR 후 Excel 프로그램을 사용하여 로그 DNA 복제 수와 주기 임계값을 플로팅합니다. 선형 회귀 계산을 수행하여 결정 계수와 선형 방정식을 표시합니다. 다음으로, 선형 회귀에서 파생된 선형 방정식을 사용하여 각 목표값에 대한 복사 수를 추정합니다.
그런 다음 표준 곡선의 선형 회귀와 주어진 방정식의 매개변수를 사용하여 PCR 증폭의 효능을 계산합니다. 효율 측면에서 프라이머를 검증한 후 DNA의 절대 복제 수를 계산합니다. 자발적인 프로파지 생산이 적다는 시간적 열거는 2시간에서 세포당 가장 낮은 PFU 수와 6시간에 세포당 가장 높은 PFU 수를 시사했습니다.
그런 다음 라이소겐은 2시간에 가장 안정적이었습니다. 따라서 이 조건은 QRTPCR 프로파일링에 사용되었습니다. 유도되지 않은 배양에서 2.31 배 10에서 9 번째 사본으로 용해 복제의 초기 마커인 cro 유전자의 발현이 현저하게 증가하여 유도 후 30 분 후에 10 대 11 사본으로 3.02 배 10 번째가 관찰되었습니다.
마찬가지로, 용해 복제의 중간 단계 마커인 P 및 O 단백질도 각각 1.74 x 10에서 8번째에서 1.25 x 10 카피로, 6.05 x 10에서 두 번째에서 5.68 x 10에서 5번째 카피로 상당한 상향 조절을 보여주었습니다. 용해 복제 주기의 후기 마커는 유도되지 않은 배양물에서 유도 후 30분까지 발현이 상당히 증가했음을 나타냈습니다. 테스트된 내부 대조군 중 RPOD는 16개의 SRNA 또는 ProC 유전자에 비해 가장 안정적인 발현을 보였습니다.
용해 복제에 대한 마커와 비교했을 때, C-one 유전자의 발현은 비교적 안정적이었습니다. 그럼에도 불구하고, C-one 유전자의 복제 수는 용해 복제에 대한 마커와 비교하여 유도되지 않은 배양에서 안심할 수 있을 정도로 높았습니다. 제대로 준비된 RNA 라이브러리에서는 좋은 데이터나 해석을 얻을 수 없습니다.
자발적 유도와 RNA 무결성을 제어하는 것이 가장 중요합니다. 모든 유전자의 시간적 역학은 발현 프로파일링을 사용하여 연구할 수 있습니다. 올바른 실험 조건과 시점을 조정하는 것은 모든 자극에 대한 생물학적 반응을 올바르게 매핑하는 데 중요합니다.
이 기술은 두 개의 서로 다른 프로파지 숙주 파트너십 사이의 이전에 알려지지 않은 상호 작용을 식별했습니다. 대부분의 박테리아는 연구되지 않은 프로파지를 수용하기 때문에 이 접근법은 많은 새로운 치료 표적 또는 응용 분야를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.
