1.2K Views
•
09:23 min
•
January 5th, 2024
DOI :
January 5th, 2024
•0:04
Introduction
1:20
Temporal Direct Enumeration of Spontaneous Induction
2:56
Preparation of Un‐Induced and Induced Lysogen Cultures for RNA Extraction
5:00
Standard Curve and Quantitative‐PCR
6:42
Results: Understanding the Impact of Prophages on Their Hosts Using PFU and RT‐qPCR
8:23
Conclusion
Transcript
Profager er bakteriefager, som har integrert seg i bakteriegenomer. Vi bruker en transkriptomisk tilnærming for å undersøke virkningen av profager på biologien til deres bakterielle verter. Metodene beskrevet her adresserer hovedutfordringen med spontan induksjon av profaglytisk syklus.
Forsiktig optimalisering av kulturforhold muliggjør ren profilering av genuttrykk under profagtilstanden. Prophages finnes i de fleste bakterielle patogener, men betydningen er vanligvis ikke forstått. Disse verktøyene kan belyse rollen som profager som regulatorer av flere bakterielle funksjoner.
Det er nesten ubegrensede profagvertsforhold som forblir ustuderte. Dette representerer en stor uutnyttet ressurs av potensielle terapeutiske mål som disse protokollene kan bidra til å forutsi. Hovedutfordringen er å finne den rette dyrkningsbetingelsen for å balansere lysogenvekst og spontan profaginduksjon.
Den velkjente sekundære utfordringen, lyson, opprettholder RNA-integriteten for nedstrømsstudier. For å begynne å sette opp ferske lysogen- og indikatorvertskulturer ved å inokulere nattens kulturer i 100 milliliter LB i forholdet en til 100. Inkuber ved 37 grader Celsius med risting ved 180 RPM.
For å overvåke lysogenvekst, samle en milliliter prøve hver time fra inokuleringspunktet i åtte timer. Serielt, fortynn kulturen ved å tilsette 100 mikroliter i 900 mikroliter av LV-mediet. Vortex med maksimal hastighet, og fortsett fortynningsserien fra 10 til minus en til 10 til minus ni.
Spot 10 mikroliter av den nødvendige fortynningen på en LB-skrueplate. La tørke og inkubere ved 30 grader Celsius i 18 til 24 timer. Etter inkubering, telle antall kolonier og beregne antall levedyktige bakterieceller ved hjelp av den gitte formelen.
Deretter, for å oppregne de smittsomme fagpartiklene i den tidsmessige prøven, tilsett 100 mikroliter logfase rifampicinresistente indikatorvertsceller til den smeltede toppskruen, sammen med rifampicin. Spot 10 mikroliter serielt fortynnet lysogenkultur på det inokulerte toppskruelaget. Tillat å tørke og inkubere ved 37 grader Celsius i 18 til 24 timer.
Etter inkubering, telle antall plakk og beregne smittsomme fagpartikler ved hjelp av den gitte formelen. Merk den første kolben som ikke-indusert og de andre som indusert, sammen med tidspunktene når hver prøve skal høstes. Deretter subkultur de over natten dyrkede lysogene kulturer i 80 milliliter LB i et forhold på en til 100 i åtte 250 milliliter kolber.
Inkuber kolbene ved 37 grader Celsius med risting ved 180 RPM. Etter 90 minutter, når den optiske tettheten ved 600 nanometer er mellom 0,1 og 0,2, tilsett fire mikroliter 1% iseddik til den ikke-induserte kolben. Legg til 80 milliliters kulturen fra den ikke-induserte kolben til 720 ml LB og tilsett umiddelbart 160 ml stoppløsning før kolben legges på is i 30 minutter for å stabilisere RNA-transkripsjonene.
Deretter tilsettes norfloxacin ved en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter til den induserte merkede kolben som inneholder 80 ml kultur. Bland godt og inkuber ved 37 grader Celsius med risting ved 180 RPM i en time. La cellene gjenopprette ved å legge til 80 ml indusert kultur til 720 ml LB. Høst bakteriecellene fra hver kolbe hvert 10. minutt fra null til en time ved å legge til en stoppløsning.
Sentrifuge ved 10.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. Før pelleten forsiktig suspenderes i restvæsken ved hjelp av den justerbare automatiske pipetten. Overfør suspensjonen til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 13 000 G i ett minutt ved fire grader Celsius.
Kast den gjenværende supernatanten og forsegl mikrofugerøret, før du blitzfryser pelletsene til flytende nitrogen. Tilsett en milliliter Trizol til hver frossen pellet, og homogeniser suspensjonen ved pipettering. Etter å ha identifisert et sett med målgener som kan fungere som markører for hvert stadium av replikasjon av fagen av interesse, amplifisere hvert av målgenene fra genomisk DNA ved hjelp av relevante primere.
Utfør PCR ved hjelp av forsterkningsbetingelsene beskrevet i tekstmanuskriptet. Etter PCR bruker du et PCR-rensesett til å rense hver amplikon og klone dem i en TA-kloningsvektor i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft sekvensen for hvert klonede produkt ved Sanger-sekvensering.
Etter å ha beregnet kopinummeret til fire individuelle plasmider, utarbeide en standardmal for hvert markørgen ved serielt å fortynne plasmid-DNA i nukleasefritt vann. Legg til en mikroliter CDNA og respektive plasmidstandarder for hvert mål i en 96-brønnplate. Og utfør kvantitativ PCR i henhold til produsentens instruksjoner.
Etter PCR, bruk Excel-programmet til å plotte loggens DNA-kopinummer kontra syklusterskelen. Utfør en lineær regresjonsberegning for å vise bestemmelseskoeffisienten og en lineær ligning. Deretter estimerer du kopinummeret for hvert mål ved hjelp av den lineære ligningen avledet fra den lineære regresjonen.
Beregn deretter effekten av PCR-amplifikasjonen ved hjelp av parametrene fra den lineære regresjonen til standardkurven og den gitte ligningen. Etter å ha validert primere med hensyn til deres prosentvise effektivitet, beregner du det absolutte kopinummeret til DNA. Tidsmessig oppregning av spontan mindre profagproduksjon antydet de laveste PFU-tallene per celle etter to timer og de høyeste PFU-tallene per celle etter seks timer.
Lysogenet var da mest stabilt på to timer. Så denne tilstanden ble brukt til QRTPCR-profilering. En markert økning i uttrykket av cro-genet, en tidlig markør for lytisk replikasjon fra 2,31 ganger 10 til niende kopier i ikke-induserte kulturer til 3,02 ganger 10 til 11. kopier 30 minutter etter induksjon ble observert.
På samme måte viste P- og O-proteiner, midttrinnsmarkøren for lytisk replikasjon, også signifikant oppregulering fra 1,74 ganger 10 til åttende til 1,25 ganger 10 til 10. kopier, og fra 6,05 ganger 10 til andre til 5,68 ganger 10 til femte kopier henholdsvis. Den sene markøren for den lytiske replikasjonssyklusen viste en betydelig økning i uttrykk i ikke-induserte kulturer til 30 minutter etter induksjon. Blant de testede internkontrollene hadde RPOD det mest stabile uttrykket sammenlignet med 16 SRNA- eller ProC-gener.
Sammenlignet med markørene for lytisk replikasjon var uttrykket av C-en-genet relativt stabilt. Likevel var kopinummeret til C-en-genet betryggende høyt i de ikke-induserte kulturene, sammenlignet med markørene for lytisk replikasjon. Ingen gode data eller tolkninger kan komme fra et dårlig forberedt RNA-bibliotek.
Kontroll av spontan induksjon og RNA-integritet er de viktigste tingene. Temporal dynamikk av et hvilket som helst gen kan studeres ved hjelp av uttrykksprofilering. Å skreddersy de riktige eksperimentelle forholdene og tidspunktene er viktig for riktig kartlegging av biologiske responser på eventuelle stimulanser.
Denne teknikken har identifisert tidligere ukjente interaksjoner mellom to forskjellige profagvertspartnerskap. Siden de fleste bakterier huser ustuderte profager, kan denne tilnærmingen bidra til å oppdage mange nye terapeutiske mål eller applikasjoner.
Denne protokollen gjør det mulig å avsløre virkningen av profager på vertene. Bakteriekulturer synkroniseres ved hjelp av forhold som best støtter den lysogene tilstanden, og begrenser spontan induksjon. RT-qPCR skiller utvetydig profagbegrensede gener og de som ikke er koblet fra fagkontroll fra de som uttrykkes under den lytiske replikasjonssyklusen.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved