Name: hypothalamic kisspeptin neurons as a target for whole-cell patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings Video at JoVE.com

Diese Studie wurde von der São Paulo Research Foundation [FAPESP-Fördernummern: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); und von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV) unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo genehmigt und gemäß den ethischen Richtlinien des brasilianischen Kollegiums für Tierversuche durchgeführt.
1. Herstellung von Lösungen
<ol><li>Herstellung der inneren Lösung Anmerkungen: Die interne Lösung füllt die Patch-Clamp-Mikropipette und kommt mit dem Inneren der Zelle in Kontakt (siehe Beispiel in ...

Die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hatte einen erheblichen Einfluss auf die wissenschaftliche Gemeinschaft, da sie als von größter Bedeutung für die Entwicklung der wissenschaftlichen Forschung angesehen wurde und mehrere Entdeckungen ermöglichte. Ihr Einfluss auf die Wissenschaft reichte aus, um 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin zu kulminieren, da diese Entdeckung die Tür zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise von Ionenkanälen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen sowie z...

Hodgkin und Huxley machten den ersten intrazellulären Nachweis eines Aktionspotentials, das in mehreren wissenschaftlichen Studien beschrieben wurde. Diese Aufnahme wurde am Squid-Axon durchgeführt, das einen großen Durchmesser (~500 μm) hat, so dass eine Mikroelektrode im Axon platziert werden kann. Diese Arbeit bot große Möglichkeiten für die wissenschaftliche Forschung, die später in der Schaffung des Spannungszangenmodus gipfelte, der zur Untersuchung der ionischen Grundlagen der Erzeugung von Aktionspotentialenverwendet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8. Im Laufe der Jahre wurde die Technik verbessert und in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet 6,9. Die Erfindung der Patch-Clamp-Technik, die Ende der 1970er Jahre durch Studien von Erwin Neher und Bert Sakmann erfolgte, ermöglichte es den Forschern, einzelne Ionenkanäle und intrazelluläre Membranpotentiale oder -ströme in praktisch jedem Zelltyp mit nur einer einzigen Elektrode aufzuzeichnen 9,10,11,12. Patch-Clamp-Ableitungen können an einer Vielzahl von Gewebepräparaten, wie z. B. kultivierten Zellen oder Gewebeschnitten, entweder im Voltage-Clamp-Modus (Halten der Zellmembran auf einer festgelegten Spannung, was die Aufzeichnung von z. B. spannungsabhängigen Strömen und synaptischen Strömen ermöglicht) oder im Current-Clamp-Modus (der die Aufzeichnung von z. B. Änderungen des Ruhemembranpotentials ermöglicht, die durch Ionenströme induziert werden) durchgeführt werden. Aktionspotentiale und postsynaptische Potentialfrequenz).
Der Einsatz der Patch-Clamp-Technik ermöglichte mehrere bemerkenswerte Entdeckungen. In der Tat sind die bahnbrechenden Erkenntnisse über die elektrophysiologischen Eigenschaften von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen, die sich an den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN Kisspeptin), auch bekannt als rostraler periventrikulärer Bereich des dritten Ventrikels (RP3V), und dem Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARHKisspeptin) befinden13,14,15 sind von besonderem Interesse. Im Jahr 2010 führten Ducret et al. die ersten Aufnahmen von AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronenin Mäusen mit einem anderen elektrophysiologischen Werkzeug, der Loose-Cell-Patch-Clamp-Technik, durch. Diese Studien lieferten eine elektrische Beschreibung von AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und zeigten, dass ihre Feuermuster vom Brunstzyklus abhängen16. Im Jahr 2011 verwendeten Qiu et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, um zu zeigen, dassARH-Kisspeptin-Neuronen endogene Schrittmacherströme exprimieren17. In der Folge zeigten Gottsch et al., dass Kisspeptin-Neuronen spontane Aktivität aufweisen und sowohl h-Typ (Schrittmacher) als auch T-Typ Kalziumströme exprimieren, was darauf hindeutet, dassARH-Kisspeptin-Neuronen elektrophysiologische Eigenschaften mit anderen Schrittmacherneuronen des Zentralnervensystems teilen18. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ARH-Kisspeptin-Neurone sexuell dimorphe Feuerraten aufweisen und dass AVPV/PeN-Kisspeptin-Neurone ein bimodales Ruhemembranpotential (RMP) aufweisen, das von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (KATP) beeinflusst wird19,20. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass Gonadensteroide die spontane elektrische Aktivität der Kisspeptin-Neuronen in Mäusen positiv beeinflussen 19,20,21. Die ersten Arbeiten, die die elektrophysiologischen Eigenschaften von Kisspeptin-Neuronen untersuchen, werden erwähnt 16,17,18,19,20. Seitdem wurde in vielen Studien die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um zu zeigen, welche Faktoren/Neuromodulatoren ausreichen, um die elektrische Aktivität von Kisspeptin-Neuronen zu modulieren (Abbildung 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Angesichts der Bedeutung dieser Technik für die Untersuchung von Neuronen, die für die Fortpflanzung benötigt werden, neben anderen Zelltypen, die hier nicht behandelt werden, beschreibt dieser Artikel die grundlegenden Schritte für die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, wie z. B. die Herstellung der Lösungen, das Sezieren und Schneiden des Gehirns und das Versiegeln der Zellmembran für Aufzeichnungen. Darüber hinaus werden relevante Fragen der Technik diskutiert, wie z.B. ihre Vorteile, technischen Einschränkungen und wichtigen Variablen, die für eine optimale experimentelle Leistung kontrolliert werden müssen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Compounds for aCSF, internal and slicing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>O3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>225711</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>DD1440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM833C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>81-333-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 365 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Roe-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteotome</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>Warner Instruments/Harvard apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>can be made in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific /various</td>
			<td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific /various</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>Commander Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X wide field system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>Image acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>Commander Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Pclamp 10 Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved hemostatic forcep</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>LOCTITE/various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (micropipette)</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>65-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipette&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>CLS7095B9-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for brain dissection</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>TEDP-121-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for the vibratome</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>TEDP-121-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>71-72, 48,49;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone teat</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Merck Millipore Ltda</td>
			<td>SLGVR13SL</td>
			<td>Millex-GV 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>131, 1518</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hypothalamic kisspeptin neurons as a target for whole-cell patch-clamp recordings

Kisspeptine sind essentiell für die Reifung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) und die Fruchtbarkeit. Hypothalamische Kisspeptin-Neuronen, die sich im anteroventralen periventrikulären Kern und rostralen periventrikulären Kern sowie im Nucleus arcuatus des Hypothalamus befinden, projizieren unter anderem auf Neuronen des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH). Frühere Studien haben gezeigt, dass der Kisspeptin-Signalweg über den Kiss1-Rezeptor (Kiss1r) erfolgt, was letztendlich die Aktivität des GnRH-Neurons anregt. In Menschen und experimentellen Tiermodellen sind Kisspeptine ausreichend, um die GnRH-Sekretion und damit die Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu induzieren. Da Kisspeptine eine wesentliche Rolle bei den Fortpflanzungsfunktionen spielen, arbeiten die Forscher daran, zu untersuchen, wie die intrinsische Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu reproduktionsbezogenen Aktionen beiträgt, und die primären Neurotransmitter/Neuromodulatoren zu identifizieren, die diese Eigenschaften verändern können. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hat sich zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Aktivität von Kisspeptin-Neuronen in Nagetierzellen entwickelt. Diese experimentelle Technik ermöglicht es den Forschern, spontane erregende und hemmende Ionenströme, das Ruhemembranpotential, das Aktionspotentialfeuer und andere elektrophysiologische Eigenschaften von Zellmembranen aufzuzeichnen und zu messen. In der vorliegenden Arbeit werden entscheidende Aspekte der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, bekannt als elektrophysiologische Messungen, die hypothalamische Kisspeptin-Neurone definieren, und eine Diskussion relevanter Fragen zur Technik besprochen.

Um die möglichen Auswirkungen von humanem rekombinantem Wachstumshormon (hGH) auf die Aktivität von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu untersuchen, führten wir Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen in Hirnschnitten durch und untersuchten, ob dieses Hormon akute Veränderungen in der Aktivität von AVPV/PeN-Kisspeptin- undARH-Kisspeptin-Neuronen verursacht. In dieser Studie wurden adulte weibliche (Diestrus-Stadium) und männliche Kiss1-Cre/GFP-Mäuse36 verwendet. Für die...

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Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings Video (Video) | JoVE

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem eine Ganzzell-Patchklemme auf Hirnschnitten durchgeführt werden kann, die Kisspeptin-Neuronen, den primären Modulator von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Zellen, enthalten. Durch das Hinzufügen von Wissen über die Aktivität von Kisspeptin-Neuronen hat dieses elektrophysiologische Werkzeug in den letzten 20 Jahren als Grundlage für bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Neuroendokrinologie gedient.

Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Durch die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellmembranen beweist die Hauptfrage, dass die elektrische Aktivität einer Zelle moduliert werden kann. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine periphere Technik, um Ionenströme in einzelnen Zellen zu untersuchen und die zelluläre Reaktion auf verschiedene Reize zu untersuchen. Die beste Leistung bei Ganzzell-Patch-Clamp-Pre-Recordings wird nach viel Üben und Lernen erreicht.Um mit der Gehirndissektion zu beginnen, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut an der Oberseite des Schädels des enthaupteten Tieres von caudle nach rostral und entfernen Sie die Kopfhaut. Als nächstes schneiden Sie mit der Irisschere die interparietale Platte entlang der sagittalen Naht ab und entfernen Sie das Hinterhauptbein. Schieben Sie das Osteotom unter das Scheitelbein und ziehen Sie es vorsichtig heraus, bis das Gehirn freiliegt.Nachdem Sie das Gehirn freigelegt haben, drehen Sie den Kopf auf den Kopf. Senken Sie das Gehirn sanft ab, um den Trigeminusnerv auf jeder Seite sichtbar zu machen. Schneiden Sie dann den Trigeminusnerv mit einer gebogenen Castroviejo-Schere durch.Nachdem Sie den Hypothalamus visualisiert haben, identifizieren Sie den Sehnerv und schneiden Sie ihn vorsichtig durch. Schneiden Sie als Nächstes den vorderen Teil des Frontallappens ab. Entfernen Sie das Gehirn und tauchen Sie es sofort in die Schneidelösung, bis Sie die Scheiben erhalten.Um die Gehirnproben in Scheiben zu schneiden, legen Sie das Gehirn auf ein Filterpapier, um die überschüssige Lösung zu trocknen. Führen Sie dann mit einer scharfen Rasierklinge einen koronalen Schnitt durch, bei dem der Hirnstamm mit dem Kleinhirn vom Rest des Gewebes getrennt wird. Kleben Sie dann den Caudle-Teil des Gehirns an die Basis eines Vibratoms und füllen Sie die Schneidekammer mit der auf null bis zwei Grad Celsius gekühlten Schneidelösung oder Liquorlösung.Packen Sie Trockeneis um die Vibratomkammer, um die Schneidelösung während des Vorgangs kalt zu halten. Führen Sie die Rasierklinge in das Vibratom ein und stellen Sie die Schneidparameter des Geräts ein, z. B. Geschwindigkeit auf drei, Frequenz auf neun und Vorschub auf 250 Mikrometer. Übertragen Sie die Scheiben während des Gewebeaufschnitts mit einer Acryl-Transferpipette in die Auffangkammer und warten Sie 60 Minuten auf die Gewebeerholung nach der Schichtgewinnung.Bevor Sie mit der Zellversiegelung und -aufzeichnung beginnen, schalten Sie das Mikroskop, den Verstärker, den Digitizer und den Mikromanipulator ein. Bauen Sie die am Mikroskop befestigte Aufnahmekammer mit der aCSF-Lösung. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den aCSF konstant mit zwei Millilitern pro Minute zu perfundieren.Überprüfen Sie die Softwareeinstellungen und erstellen Sie je nach Art des Experiments spezifische Protokolle für die Aufzeichnungen. Übertragen Sie eine Gehirnscheibe, die Sie interessiert, nacheinander mit einer Acryl-Transferpipette in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit einem Scheibenanker fest, damit sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt.Positionieren Sie die Scheibe in der Mitte der Aufnahmekammer mit der Objektivlinse des Immersionsmikroskops mit geringer Leistung, 10X oder 20X. Die Schichtposition ist entscheidend, um eine gute Sicht auf den gewünschten Bereich unter dem Mikroskop zu ermöglichen und eine perfekte Reichweite für die aufnehmende Mikropipette zu gewährleisten. Nachdem Sie den interessierenden Bereich lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse 63X um und konzentrieren Sie sich auf die Gewebeebene, wobei Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptinzellen auf der Oberfläche des Gehirnschnitts zu lokalisieren.Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format wie ein Quadrat über den Interessenbereich zeichnen. Die Markierung des Computerbildschirms hilft dabei, die Position der Aufnahmepipette zur Zelle zu führen. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Aufnahmemikropipette in den Elektrodenhalter ein, wobei darauf zu achten ist, dass die interne Lösung mit der Silberelektrode in Kontakt steht.Üben Sie einen Überdruck aus, bevor Sie die Mikropipette mit einer luftgefüllten Spritze von ein bis drei Millilitern, die über einen Polyethylenschlauch mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, in die aCSF-Lösung tauchen, um das Eindringen von Schmutz in die Mikropipette zu verhindern. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unterhalb der Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten des Mikromanipulators, um die XYZ-Achse der Mikropipette in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Spitze der Mikropipette zu sehen ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nahe an die Scheibe. Verringern Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene ab, wobei darauf zu achten ist, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Zelloberfläche oder den Zielbereich berührt. Leichter Überdruck mit einer luftgefüllten Spritze von ein bis drei Millilitern, um Schmutz aus der Anflugbahn zu entfernen.Bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der XYZ-Achse, um die Mikropipettenspitze näher zu bringen und die Zielzelle zu berühren, die durch den ausgeübten Druck eine Vertiefung verursacht. Nachdem Sie die Vertiefung mit Hilfe des Voltage-Clamp-Modus in der Software hergestellt haben, saugen Sie ein bis zwei Sekunden lang schwach und kurz durch den Mund, der mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, um die Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen. Wenn die Dichtung etwa eine Minute lang mechanisch stabil bleibt, ohne dass es zu Störungen kommt, stellen Sie die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der zu untersuchenden Zelle ein.Für Kisspeptin werden hypothalamische Neuronen minus 50 Millivolt empfohlen. Saugen Sie anschließend kurz mit dem Mund an, um die Plasmamembran an der Mikropipettenspitze zu brechen, die mit der Zelle versiegelt ist, damit die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft oder einen beträchtlichen Membranabschnitt oder die Zelle anzieht. Eine adäquate Gesamtzellkonfiguration kann erreicht werden, indem mit ausreichender Kraft abgesaugt wird.Überprüfen Sie das verwendete Handbuch für die Systemeinstellungen. Nachdem Sie die Zellmembran gebrochen haben, aktivieren Sie die Option "Gesamte Zelle" im Spannungszangenmodus und klicken Sie auf den automatischen Befehl, der sich auf die Registerkarte "Gesamte Zelle" bezieht. Der Serienwiderstand der Zelle und die Kapazität der gesamten Zelle werden automatisch berechnet und sofort von der Software angezeigt.Überprüfen Sie als Nächstes die Parameter der Zellviabilität in der Software, wie im Textmanuskript beschrieben. Überwachen Sie den Serienwiderstand und die stationäre Kapazität der Zelle während der Experimente. Sobald die gesamte Zellkonfiguration richtig erreicht ist, messen Sie synaptische Ströme im Voltage-Clamp-Modus.Zeichnen Sie die Änderungen des Ruhemembranpotentials und die induzierten Schwankungen des Ruhemembranpotentials im Stromklemmmodus auf. Die möglichen Auswirkungen von humanem rekombinantem Wachstumshormon auf die Aktivität von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen wurden mit Hilfe von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen untersucht. Die Verabreichung des humanen rekombinanten Wachstumshormons HGH in einer Dosierung von 20 Mikrogramm pro Gramm induzierte eine signifikante Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials in 5 von 12 AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und 9 von 14 aufgezeichneten ARH-Kisspeptin-Neuronen.Die hyperpolarisierten AVPV/PeN-Kisspeptin- und ARH-Kisspeptin-Neurone veränderten das Ruhemembranpotential signifikant im Vergleich zu den nicht reagierenden Zellen. Die Effekte auf das Ruhemembranpotential während der HGH-Applikation folgten einer signifikanten Reduktion des Ganzzell-Eingangswiderstands von etwa 0,9 bis 0,7 Gigaohm auf AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und 1,7 bis 1,0 Gigaohm auf ARH-Kisspeptin-Neuronen. Während der perfekten Gehirnlinien, die über eine sorgfältige Gigaseal durchgeführt werden, und der Bereichssache an der Zelle über Strandparameter sind die Parameter erforderlich, um die besten Ganzzellableitungen zu erzielen.Die Mikropipettenlösung der aufgezeichneten Zelle kann gesammelt und für Einzelzell-RTPCR verwendet werden, was die molekulare Charakterisierung einer isolierten Zelle ermöglicht. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik in Kombination mit der Verwendung genetisch veränderter Tiere stellt einen Durchbruch im Verständnis der Fortpflanzung dar, die es ermöglicht, die Eigenschaften von Kisspeptin-Neuronen zu definieren, und sie sind wichtige Modulatoren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation (Video) | JoVE 

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish (Video) | JoVE 

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation (Video) | JoVE 

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents (Video) | JoVE 

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons Video (Video) | JoVE

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices Video (Video) | JoVE

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons Video (Video) | JoVE

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins Video (Video) | JoVE

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons Video (Video) | JoVE

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons Video (Video) | JoVE

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...