Name: hypothalamic kisspeptin neurons as a target for whole-cell patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings Video at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione di ricerca di San Paolo [numeri di sovvenzione FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); e dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Codice finanziario 001" (HRV).

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo e sono state eseguite secondo le linee guida etiche adottate dal Collegio brasiliano di sperimentazione animale.
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparazione della soluzione interna NOTA: La soluzione interna riempie la micropipetta patch-clamp e contatterà l'interno della cella (vedere un esempio nella <strong class="...

Lo sviluppo della tecnica patch-clamp a cellule intere ha avuto un impatto significativo sulla comunità scientifica, essendo considerato di fondamentale importanza per lo sviluppo della ricerca scientifica e consentendo diverse scoperte. Il suo impatto sulla scienza è stato sufficiente per culminare nel premio Nobel per la medicina nel 1991, poiché questa scoperta ha aperto la porta a una migliore comprensione di come funzionano i canali ionici in condizioni fisiologiche e patologiche, nonché all'identificazione<sup ...

Hodgkin e Huxley hanno fatto la prima registrazione intracellulare di un potenziale d'azione descritto in diversi studi scientifici. Questa registrazione è stata eseguita sull'assone del calamaro, che ha un grande diametro (~ 500 μm), consentendo di posizionare un microelettrodo all'interno dell'assone. Questo lavoro ha fornito grandi possibilità per la ricerca scientifica, culminando in seguito nella creazione del modo di morsetto di tensione, che è stato utilizzato per studiare la base ionica della generazione del potenziale d'azione 1,2,3,4,5,6,7,8. Nel corso degli anni, la tecnica è stata migliorata ed è diventata ampiamente applicata nella ricerca scientifica 6,9. L'invenzione della tecnica patch-clamp, avvenuta alla fine del 1970 attraverso studi avviati da Erwin Neher e Bert Sakmann, ha permesso ai ricercatori di registrare singoli canali ionici e potenziali o correnti di membrana intracellulare praticamente in ogni tipo di cellula utilizzando un solo elettrodo 9,10,11,12. Le registrazioni patch-clamp possono essere effettuate su una varietà di preparati tissutali, come cellule coltivate o fette di tessuto, in modalità tension-clamp (mantenendo la membrana cellulare a una tensione impostata che consente la registrazione, ad esempio, di correnti dipendenti dalla tensione e correnti sinaptiche) o in modalità current-clamp (consentendo la registrazione, ad esempio, delle variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte da correnti ioniche, potenziali d'azione e frequenza del potenziale postsinaptico).
L'uso della tecnica patch-clamp ha reso possibili diverse scoperte degne di nota. Infatti, i risultati seminali sulle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni ipotalamici kisspeptin situati nei nuclei periventricolare anteroventrale e periventricolare rostrale (AVPV / PeN Kisspeptin), noto anche come area periventricolare rostrale del terzo ventricolo (RP3V), e il nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARHkisspeptin)13,14,15 sono di particolare interesse. Nel 2010, Ducret et al. hanno eseguito le prime registrazioni di neuroni AVPV / PeNKisspeptinnei topi utilizzando un altro strumento elettrofisiologico, la tecnica patch-clamp a cellule sciolte. Questi studi hanno fornito una descrizione elettrica dei neuroni AVPV/PeNKisspeptin e hanno dimostrato che i loro schemi di attivazione sono estrali dipendenti dal ciclo16. Nel 2011, Qiu et al. hanno utilizzato la tecnica dell'intero patch-clamp cellulare per dimostrare che i neuroni ARHkisspeptin esprimono correnti pacemaker endogene17. Successivamente, Gottsch et al. hanno dimostrato che i neuroni kisspeptin mostrano attività spontanea ed esprimono sia correnti di calcio di tipo H (pacemaker) che di tipo T, suggerendo che i neuroni ARHkisspeptin condividono proprietà elettrofisiologiche con altri neuroni pacemaker del sistema nervoso centrale18. Inoltre, è stato dimostrato che i neuroni ARH kisspeptin mostrano velocità di attivazione sessualmente dimorfiche e che i neuroni AVPV/PeNKisspeptin mostrano un potenziale di membrana a riposo bimodale (RMP) influenzato dai canali del potassio sensibili all'ATP (KATP)19,20. Inoltre, è stato stabilito che gli steroidi gonadici influenzano positivamente l'attività elettrica spontanea dei neuroni kisspeptina nei topi 19,20,21. I primi lavori che studiano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni kisspeptina sono menzionati 16,17,18,19,20. Da allora, molti studi hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell'intera cellula per dimostrare quali fattori/neuromodulatori sono sufficienti a modulare l'attività elettrica dei neuroni kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Data l'importanza di questa tecnica per lo studio dei neuroni necessari per la riproduzione, tra gli altri tipi di cellule non trattati qui, questo articolo descrive i passaggi fondamentali per lo sviluppo della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, come la preparazione delle soluzioni, la dissezione e il taglio del cervello e l'esecuzione del sigillo della membrana cellulare per le registrazioni. Inoltre, vengono discusse questioni rilevanti sulla tecnica, come i suoi vantaggi, i limiti tecnici e le variabili importanti che devono essere controllate per prestazioni sperimentali ottimali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compounds for aCSF, internal and slicing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>O3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>225711</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>DD1440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM833C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>81-333-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 365 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Roe-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteotome</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>Warner Instruments/Harvard apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>can be made in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific /various</td>
			<td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific /various</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>Commander Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X wide field system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>Image acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>Commander Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Pclamp 10 Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved hemostatic forcep</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>LOCTITE/various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (micropipette)</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>65-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipette&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>CLS7095B9-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for brain dissection</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>TEDP-121-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for the vibratome</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>TEDP-121-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>71-72, 48,49;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone teat</td>
			<td>various</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Merck Millipore Ltda</td>
			<td>SLGVR13SL</td>
			<td>Millex-GV 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Bonther equipamentos &#38; Tecnologia/various</td>
			<td>131, 1518</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hypothalamic kisspeptin neurons as a target for whole-cell patch-clamp recordings

Le kisspeptine sono essenziali per la maturazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) e la fertilità. I neuroni kisspeptina ipotalamici situati nel nucleo periventricolare anteroventrale e nel nucleo periventricolare rostrale, così come il nucleo arcuato dell'ipotalamo, proiettano i neuroni dell'ormone di rilascio della gonadotropina (GnRH), tra le altre cellule. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione della kisspeptina avviene attraverso il recettore Kiss1 (Kiss1r), in ultima analisi, eccitando l'attività dei neuroni GnRH. Nell'uomo e nei modelli animali sperimentali, le kisspeptine sono sufficienti per indurre la secrezione di GnRH e, di conseguenza, il rilascio di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH). Poiché le kisspeptine svolgono un ruolo essenziale nelle funzioni riproduttive, i ricercatori stanno lavorando per valutare come l'attività intrinseca dei neuroni ipotalamici della kisspeptina contribuisca alle azioni correlate alla riproduzione e identificare i neurotrasmettitori primari / neuromodulatori in grado di modificare queste proprietà. La tecnica patch-clamp dell'intera cellula è diventata uno strumento prezioso per studiare l'attività dei neuroni kisspeptina nelle cellule dei roditori. Questa tecnica sperimentale consente ai ricercatori di registrare e misurare le correnti ioniche eccitatorie e inibitorie spontanee, il potenziale di membrana a riposo, il potenziale d'azione e altre proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari. Nel presente studio, vengono esaminati aspetti cruciali della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, nota come misurazioni elettrofisiologiche che definiscono i neuroni kisspeptin ipotalamici e una discussione di questioni rilevanti sulla tecnica.

Per studiare i possibili effetti dell'ormone della crescita umano ricombinante (hGH) sull'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptina, abbiamo eseguito registrazioni patch-clamp di intere cellule in fette di cervello e valutato se questo ormone provoca cambiamenti acuti nell'attività dei neuroni AVPV / PeNkisspeptin e ARHkisspeptin. In questo studio sono stati utilizzati topi adulti Kiss1-Cre/GFP femmina (stadio di diestro) e topi maschi36. Per gli esperimenti sono stati ...

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Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings Video (Video) | JoVE

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptina, il modulatore primario delle cellule dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Aggiungendo conoscenze sull'attività dei neuroni kisspeptina, questo strumento elettrofisiologico è servito come base per progressi significativi nel campo della neuroendocrinologia negli ultimi 20 anni.

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Misurando le proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari, la questione del principale dimostra che modulare l'attività elettrica di una cellula può essere risolta. La registrazione del patch clamp dell'intera cellula è una tecnica periferica per studiare le correnti ioniche nelle singole cellule e interrogare la risposta cellulare a diversi stimoli. Le migliori prestazioni sulle pre-registrazioni di patch clamp a cellule intere saranno raggiunte dopo aver praticato e studiato molto.Per iniziare la dissezione cerebrale fare un'incisione usando forbici chirurgiche nella pelle nella parte superiore del cranio dell'animale decapitato dal caudle al rostrale e rimuovere il cuoio capelluto. Quindi, tagliare la piastra interparietale lungo la sutura sagittale con le forbici dell'iride e rimuovere l'osso occipitale. Far scorrere l'osteotomo sotto l'osso parietale e tirarlo delicatamente fuori fino a quando il cervello è esposto.Dopo aver esposto il cervello, capovolgi la testa. Abbassare delicatamente il cervello per visualizzare il nervo trigemino su ciascun lato. Quindi tagliare il nervo trigemino usando le forbici curve Castroviejo.Dopo aver visualizzato l'ipotalamo identificare il nervo ottico e tagliarlo delicatamente. Quindi, tagliare la porzione anteriore del lobo frontale. Rimuovere il cervello e immergerlo immediatamente nella soluzione di affettatura fino ad acquisire le fette.Per tagliare i campioni di cervello, posizionare il cervello su una carta da filtro per asciugare la soluzione in eccesso. Quindi con una lama di rasoio tagliente affilata eseguire un taglio coronale separando il tronco cerebrale con il cervelletto dal resto del tessuto. Quindi, incollare la porzione caudle del cervello alla base di un vibratomo e riempire la camera del dispositivo di affettatura con la soluzione di affettatura o la soluzione aCSF raffreddata da zero a due gradi Celsius.Imballare ghiaccio secco intorno alla camera di vibratomo per mantenere fredda la soluzione affettante durante la procedura. Inserire la lama del rasoio nella vibratoma e impostare i parametri di taglio del dispositivo, come la velocità a tre, la frequenza a nove e l'alimentazione a 250 micrometri. Durante la procedura di affettatura del tessuto trasferire le fette utilizzando una pipetta di trasferimento acrilico nella camera di recupero e attendere 60 minuti per il recupero del tessuto dopo l'acquisizione della fetta.Prima di iniziare la sigillatura e la registrazione delle cellule, accendere il microscopio, l'amplificatore, il digitalizzatore e il micromanipolatore. Costruire la camera di registrazione collegata al microscopio con la soluzione aCSF. Utilizzare una pompa di perfusione per perfondere costantemente l'aCSF a due millilitri al minuto.Controlla le impostazioni del software e crea protocolli specifici per le registrazioni in base al tipo di esperimento. Trasferire una fetta di cervello di interesse una alla volta nella camera di registrazione usando una pipetta di trasferimento acrilica. Tenere la fetta con un ancoraggio di fetta in modo che non si muova durante la perfusione aCSF.Posizionare la fetta al centro della camera di registrazione utilizzando l'obiettivo a bassa potenza del microscopio ad immersione, 10X o 20X. La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una portata perfetta per la micropipetta di registrazione. Dopo aver individuato la regione di interesse, passare la lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza, 63X e concentrarsi sul livello del tessuto osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione bersaglio per localizzare le cellule kisspeptina sulla superficie della fetta di cervello.Quando si trova una possibile cella di destinazione, contrassegnarla sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato come un quadrato sopra l'area di interesse. Il segno dello schermo del computer aiuta a guidare la posizione della pipetta di registrazione verso la cella. Dopo aver determinato la posizione esatta della cella bersaglio, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna nel supporto dell'elettrodo assicurandosi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF utilizzando una siringa riempita d'aria da uno a tre millilitri collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo di polietilene per evitare che i detriti entrino nella micropipetta. Utilizzando il micro manipolatore guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti del micromanipolatore per guidare l'asse XYZ della micropipetta verso la cella di interesse.Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo vicino alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta fino al piano di messa a fuoco, assicurandosi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma scenda lentamente fino a toccare la superficie della cella o la regione target. Applicare una leggera pressione positiva con una siringa riempita d'aria da uno a tre millilitri per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.Spostare lentamente il micromanipolatore sull'asse XYZ per avvicinare la punta della micropipetta e toccare la cella bersaglio che provoca una fossetta a causa della pressione applicata. Dopo aver stabilito la fossetta con l'aiuto della modalità di morsetto di tensione sul software, applicare una breve aspirazione debole per bocca per uno o due secondi attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta e la cella. Se la tenuta rimane meccanicamente stabile senza interferenze di rumore per circa un minuto, impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse.Per i neuroni ipotalamici kisspeptin meno 50 millivolt è raccomandato. Quindi, applicare una breve aspirazione per via orale per rompere la membrana plasmatica sulla punta della micropipetta sigillata posizionata sulla cellula in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta o attiri una porzione di membrana considerevole o la cellula. Un'adeguata configurazione dell'intera cella può essere ottenuta eseguendo l'aspirazione con forza sufficiente.Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Dopo aver rotto la membrana della cella, abilitare l'opzione dell'intera cella in modalità morsetto di tensione e fare clic sul comando automatico che si riferisce all'intera scheda della cella. La resistenza in serie della cella e la capacità dell'intera cella vengono calcolate automaticamente e visualizzate istantaneamente dal software.Quindi, controllare i parametri di vitalità delle celle nel software come descritto nel manoscritto di testo. Monitorare la resistenza in serie e la capacità di stato stazionario della cella durante gli esperimenti. Una volta raggiunta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità morsetto di tensione.Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo e le variazioni del potenziale di membrana a riposo indotto nella modalità di morsetto corrente. I possibili effetti dell'ormone della crescita umano ricombinante sull'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptin sono stati studiati con l'aiuto di registrazioni di patch clamp a cellule intere. La somministrazione dell'ormone della crescita umano ricombinante, HGH a 20 microgrammi per grammo ha indotto una significativa iperpolarizzazione del potenziale di membrana a riposo in 5 su 12 neuroni AVPV / PeN kisspeptin e 9 su 14 neuroni ARH kisspeptin registrati.I neuroni iperpolarizzati AVPV/PeN kisspeptin e ARH kisspeptin hanno modificato significativamente il potenziale di membrana a riposo rispetto alle cellule non responsive. Gli effetti sul potenziale di membrana a riposo durante l'applicazione di HGH hanno seguito una significativa riduzione della resistenza di input dell'intera cellula di circa 0,9-0,7 gigaohm sui neuroni kisspeptin AVPV / PeN e da 1,7 a 1,0 gigaohm sui neuroni ARH kisspeptin. Durante le linee cerebrali perfette eseguite tramite un'attenta gigaseal e l'area della cellula tramite spiaggia, sono necessari parametri per ottenere le migliori registrazioni di cellule intere.La soluzione di micropipette della cellula registrata può essere raccolta e utilizzata per RTPCR a singola cellula consentendo la caratterizzazione molecolare di una cellula isolata. La tecnica del patch clamp a cellule intere combinata con l'uso di animali geneticamente modificati rappresenta una svolta nella comprensione della riproduzione che consente la definizione di neuroni kisspeptina maggiori proprietà e sono importanti modulatori.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation (Video) | JoVE 

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Ricerca

Neuroscienze

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish (Video) | JoVE 

Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation (Video) | JoVE 

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents (Video) | JoVE 

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons (Video) | JoVE 

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices Video (Video) | JoVE

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons Video (Video) | JoVE

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins Video (Video) | JoVE

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons Video (Video) | JoVE

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

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Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons Video (Video) | JoVE

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...