Name: generating genetically modified plasmodium berghei sporozoites
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة AI168307 إلى SPK.  نشكر نواة قياس التدفق الخلوي UGA CTEGD ونواة الفحص المجهري UGA CTEGD. كما نعترف بمساهمات آش باثاك وآن إليوت وموظفي UGA Sporocore في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور دايتشي كامياما على الأفكار القيمة والمناقشة والبلازميدات الأم التي تحتوي على GFP11 و GFP 1-10. نود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر Kurup على دعمهم المستمر وصبرهم وتشجيعهم.

تم إجراء جميع الأبحاث التي شملت الحيوانات الفقارية في مختبرنا وفقا لإرشادات وبروتوكولات استخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.
1. جيل من الفئران المصابة ب P. berghei
<ol><li>بدء عدوى مرحلة الدم في ذكور أو إناث ، الفئران C57BL / 6 (B6) البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام طفيليات <e...

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneva.">Geneva.</a> World Health Organization. , 1 (2020).</li><li>Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria:+biology+and+disease.">Malaria: biology and disease.</a> Cell. 167 (3), 610-624 (2016).</li><li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+immunity+in+man+and+mosquito:+insights+into+unsolved+mysteries+of+a+deadly+infectious+disease.">Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease.</a> Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).</li><li>Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-erythrocytic+vaccines+against+malaria.">Pre-erythrocytic vaccines against malaria.</a> Vaccines. 8 (3), 400 (2020).</li><li>Balu, B., Adams, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+transfection+technologies+for+Plasmodium.">Advancements in transfection technologies for Plasmodium.</a> International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+parasites+accelerate+drug+discovery.">Transgenic parasites accelerate drug discovery.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).</li><li>Voorberg-vander Wel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+fluorescent+Plasmodium+cynomolgi+reporter+line+reveals+in+vitro+malaria+hypnozoite+reactivation.">A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation.</a> Communications Biology. 3, 7 (2020).</li><li>Christian, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transgenic+parasites+and+host+reporters+to+dissect+events+that+promote+interleukin-12+production+during+toxoplasmosis.">Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis.</a> Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).</li><li>Montagna, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+export+during+liver+infection+of+the+malaria+parasite+augments+protective+immunity.">Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity.</a> mBio. 5 (4), e01321 (2014).</li><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites-recent+advances+and+future+directions.">In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).</li><li>Siciliano, G., Alano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlightening+the+malaria+parasite+life+cycle:+bioluminescent+Plasmodium+in+fundamental+and+applied+research.">Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).</li><li>Othman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+transgenic+parasites+in+malaria+vaccine+research.">The use of transgenic parasites in malaria vaccine research.</a> Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).</li><li>Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+genetically+arrested+parasites+(GAPs)+for+a+precision+malaria+vaccine.">Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).</li><li>Otto, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+evaluation+of+rodent+malaria+parasite+genomes+and+gene+expression.">A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression.</a> BMC Biology. 12, 86 (2014).</li><li>Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+and+drug+selection+of+genetically+transformed+blood+stages+of+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei.</a> Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).</li><li>Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+gametocyte+culture+and+mosquito+infection+through+artificial+membrane+feeding.">Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).</li><li>Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+isolation+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+from+infected+mosquitoes.">Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes.</a> The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Bailey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline:+the+laboratory+diagnosis+of+malaria.+General+Haematology+Task+Force+of+the+British+Committee+for+Standards+in+Haematology.">Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology.</a> British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).</li><li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+literature+review+of+microscopy+methods+reported+in+malaria+clinical+trials.">A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).</li><li>de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+berghei+ANKA+(PbA)+infection+of+C57BL/6J+mice:+a+model+of+severe+malaria.">Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).</li><li>Musiime, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+that+a+real+oocyst?+Insectary+establishment+and+identification+of+Plasmodium+falciparum+oocysts+in+midguts+of+Anopheles+mosquitoes+fed+on+infected+human+blood+in+Tororo,+Uganda.">Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda.</a> Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).</li><li>Marques-da-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+type+I+interferon+signaling+in+hepatocytes+controls+malaria.">Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria.</a> Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).</li><li>Bowers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+Plasmodium+sporozoites.">Cryopreservation of Plasmodium sporozoites.</a> Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).</li><li>Zander, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1-like+plasmodium-specific+memory+CD4++T+cells+support+humoral+immunity.">Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity.</a> Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).</li></ol>

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا ...

وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراءالكبرى 1. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة - sporozoites - في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كرات الدم الحمراء) قبل إصابة كريات الدم الحمراء. تبدأ عدوى كريات الدم الحمراء مرحلة الدم من الملاريا وهي مسؤولة عن مجمل المراضة والوفيات المرتبطة بالمرض 2,3.
جعلت الطبيعة الإلزامية لتطور البلازموديوم قبل كريات الدم الحمراء هدفا جذابا لجهود تطوير اللقاح والأدويةالوقائية 4. شرط أساسي لدراسة بيولوجيا الملاريا قبل كريات الدم الحمراء ، وكذلك تطوير اللقاحات أو الأدوية التي تستهدف مرحلة الكبد ، هو الوصول إلى Plasmodium sporozoites. علاوة على ذلك ، كانت قدرتنا على توليد Plasmodium sporozoites المعدلة وراثيا مفيدة في نجاح هذه المساعي البحثية5،6،7،8،9. سمحت لنا خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت أو الإنارة بتتبع تطورها في الجسم الحي وفي المختبر10,11. الطفيليات الموهنة وراثيا (GAPs) ، الناتجة عن حذف جينات متعددة في البلازموديوم ، هي أيضا بعض من أكثر اللقاحات الواعدةالمرشحة 12,13.
ساعدتنا نماذج ملاريا الرئيسيات القوارض وغير البشرية على فهم آليات التفاعلات بين الطفيليات المضيفة في الملاريا البشرية بسبب أوجه التشابه في علم الأحياء ودورة الحياة بين أنواع المتصورة 14. يسمح استخدام أنواع البلازموديوم التي تصيب القوارض ، ولكن ليس البشر (على سبيل المثال ، P. berghei) بالحفاظ على دورة حياة الطفيليات الكاملة وتوليد sporozoites المعدية لدراسة الملاريا في مرحلة الكبد في بيئة خاضعة للرقابة من مستوى السلامة البيولوجية 1. توجد بالفعل مجموعة متنوعة من البروتوكولات المنفصلة لتوليد طفيليات البلازموديوم في مرحلة الدم المعدلة وراثيا 15 ، وعدوى البعوض16 ، وعزل sporozoites17. هنا ، نحدد بروتوكولا شاملا يجمع بين هذه المنهجيات من أجل توليد وعزل P. berghei sporozoites المعدلة وراثيا ، باستخدام السلالة المعدلة وراثيا الجديدة PbGFP11 كمثال. يتاجر PbGFP 11 بالشريط الحادي عشر β من بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (GFP) ، GFP11 ، في الفجوة الطفيلية (PV) المتولدة في خلايا الكبد المضيفة. يستخدم PbGFP 11 جنبا إلى جنب مع خلايا الكبد المعدلة وراثيا (خلفية Hepa1-6) التي تعبر عن المخلفات التي تشكل جزء GFP 1-10 (GFP 1-10) في السيتوبلازم (خلايا Hepa GFP 1-10). يبلغ PbGFP11 عن تحلل PV في خلايا الكبد المضيفة من خلال التكامل الذاتي وإصلاح GFP الوظيفي وإشارة التألق الخضراء18. وتجدر الإشارة إلى أن GFP 11 مشفر كسلسلة من سبعة تسلسلات ترادفية في PbGFP11 لتعزيز إشارة التألق الناتجة. عند تلطيخ PbGFP11 sporozoites مع صبغة السيتوبلازم CellTrace Violet (CTV) ، يمكننا تتبع الطفيليات. يؤدي تحلل هذه الطفيليات داخل الخلايا الملطخة ب CTV نفسها إلى تسرب CTV إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة وتلطيخ الخلية المضيفة. بالإضافة إلى تصور وتمييز تحلل Plasmodium PV و / أو الطفيلي في خلايا الكبد المضيفة ، يمكن استخدام هذا النظام بشكل موثوق لدراسة المسارات المناعية المسؤولة عن أي من هذه العمليات ، من خلال الاضطراب الجيني أو العلاجي للمكونات الجزيئية لهذه المسارات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Syringe needle</td>
			<td>Exel international</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alsever&#39;s solution</td>
			<td>Sigma-Aldritch</td>
			<td>A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VMI-1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>T1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>365967</td>
			<td>for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Chip disposable hematocytometer</td>
			<td>INCYTO</td>
			<td>DHC-N01-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVeiw Cell Culture Dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td>For gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta Vision II - Inverted microscope system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP11 plasmid</td>
			<td>Kurup Lab</td>
			<td>pSKspGFP11</td>
			<td>Generated from PL0017 plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma-Aldritch</td>
			<td>48900-1L-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa GFP1-10 cells</td>
			<td>Kurup Lab</td>
			<td>Hepa GFP1-10</td>
			<td>Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for mosquito dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>1.5 M and 0.15 M for percoll solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td>
			<td></td>
			<td>Program U-033 used for RBC electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldritch</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (Density gradient stock medium)</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td>Details in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL0017 Plasmid</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>MRA-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrimethamine (for oral administration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46706</td>
			<td>Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWoRx microscopy software</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>v6.1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating genetically modified plasmodium berghei sporozoites

الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP11) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.

يعد تحديد تواتر وتطور الفصام أمرا بالغ الأهمية لضمان وجود ما يكفي من الطفيليات القابلة للحياة في المرحلة المثلى للنقل. يمكن تمييز الفصاميات غير الناضجة عن الفصاميات الناضجة تماما من خلال وجود عدد أقل من الميروزويتات التي لا تملأ المساحة داخل الخلايا بالكامل لكرات الدم الحمراء (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites at JoVE.com

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.

توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

حاليا لدينا فهم محدود لبيولوجيا عدوى البلازموديوم في الكبد. لقد ساعدنا هذا البروتوكول في توليد الكثير من الخطوط المعدلة وراثيا التي ساعدت في الإجابة على بعض الأسئلة المهمة حول بيولوجيا الكائن الحي. هناك حاجة إلى فهم أساسي للطفيلي وبيولوجيته لتطوير أدوات ونهج جديدة لمكافحة عدوى الملاريا.ساعدتنا طريقة الجينات المحورة التي نصفها هنا في فك رموز بعض البيولوجيا الرئيسية والمعقدة للكائن الحي وكذلك المضيف. سيوضح هذا الإجراء كارسون باورز ، مدير مختبري. بعد توليد الفئران المصابة ب P.Bergehei والقتل الرحيم لها ، اجمع ملليلتر من الدم من فأرين مصابين إلى خمسة ملليلتر من محلول Elsevier في بيئة معقمة.أجهزة الطرد المركزي الدم في 450 غرام لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة. قم بطرد مركزي تعليق الخلية مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في 25 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة.انقل تعليق الخلية إلى دورق ثقافة T75 بغطاء مرشح واحتضانه بهز لطيف للحفاظ على الخلايا معلقة. في نهاية الحضانة ، اجمع 500 ميكرولتر من العينة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة.بعد ذلك ، تحضير مسحة دم رقيقة. وصمة عار مسحة الدم مع وصمة عار Giemsa وتحديد وتيرة schizonts. لتحقيق الكفاءة المثلى للانتقال ، يجب أن يكون 60 إلى 70٪ من الطفيليات في مرحلة الفصام.قم بإعداد مخزن مؤقت للطرد المركزي المتدرج عن طريق إعادة تكوين 13 ملليلتر من وسط مخزون تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. نقل 25 ملليلتر من ثقافة الدم إلى أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر. ثم ضع بعناية 20 ملليلترا من المخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي ، باستخدام ماصة زجاجية ضيقة لإنشاء عمود متدرج وضمان تقسيم واضح بين المخزن المؤقت والوسائط.أجهزة الطرد المركزي العازلة المعدة والوسائط لمدة 20 دقيقة عند 450 جم مع عدم وجود انقطاع في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة المراعي ، قم بإزالة طبقة schizont بعناية في واجهة وسائط الاستزراع والمخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج. ضعه في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.أعد تعليق schizonts المعزولة في وسائط RPMI كاملة وقم بزيادة الحجم الإجمالي إلى 40 ملليلتر. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق schizont في 10 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة. ثم انقل ملليلترا واحدا من هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر لكل عملية نقل وحبيبات الخلايا المصابة عن طريق الطرد المركزي عند 16،000 جم لمدة خمس ثوان.بعد ذلك ، ادمج 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي في درجة حرارة الغرفة مع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي للبلازميد المستهدف في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي للخلايا المصابة ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بعناية في محلول nucleoefector المحضر بالإضافة إلى الحمض النووي البلازميد. ثم انقل التعليق إلى التثقيب الكهربائي ، و cuvettes ، و transfect باستخدام برنامج nucleofector مناسب.بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة إلى كوفيت. انقل المحلول بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر وضعه على الجليد. تحقق من مستويات الطفيليات في الفئران الملقحة بالفصام المننقل يوميا من يومين بعد التلقيح.بمجرد تأكيد الإصابة ، ابدأ في اختيار الدواء عن طريق إعطاء الدواء عن طريق الفم ومياه الشرب المقدمة حسب الطلب. يجب مراقبة الطفيليات باستخدام مسحات الدم بدءا من ستة أيام بعد بدء علاج البيروميثيمين. عندما يصل الطفيلي إلى 1٪ على الأقل ، قم بنقل الطفيليات إلى فئران B6 الساذجة لإنشاء مخزون طفيلي في مرحلة الدم.بمجرد أن يصل الطفيلي إلى 2٪ إلى 5٪ ، قم بتوليد المخزونات والحفاظ عليها بالتبريد. قبل يوم واحد من إصابة البعوض ، افصل أنثى البعوض عن طريق وضع قفاز مملوء بالماء المسخن إلى 37 درجة مئوية فوق القفص الذي يحتوي على كل من البعوض من الذكور والإناث. استخدم شفاط الحشرات لإزالة إناث البعوض المنجذبة إلى مصدر الحرارة ونقلها إلى قفص أصغر للعدوى.في يوم تغذية البعوض والعدوى ، حدد الطفيليات في الفئران B6 المصابة. الطفيليات بين 2٪ إلى 5٪هو الأمثل لعدوى البعوض. بعد التحقق من طفيلي الدم ، انقل العدوى إلى أنثى البعوض عن طريق وضع الفئران المخدرة على أنثى البعوض المحبوسة تحت راقد القص.انشر الأرجل الأمامية والخلفية يدويا لتوفير أكبر مساحة سطح لتغذية البعوض. اترك الفئران المصابة في كل قفص لمدة 15 دقيقة ، وتحقق كل خمس دقائق للتأكد من أن الفئران ليست مستيقظة. بمجرد اكتمال التغذية والقتل الرحيم للفئران ، تخلص منها بأمان باتباع إرشادات المؤسسة.للتحقق من نجاح العدوى داخل البعوض ، اعزل البعوض في منتصف الأمعاء عن طريق إزالة الجزء البطني الطرفي بالملقط بعد 10 أيام من الإصابة. ثم شاهد الأمعاء الوسطى تحت الضوء المستقطب للكشف عن وجود البويضات. في 18 يوما بعد الإصابة ، قم بتشريح خمسة إلى 10 بعوض لتقييم عدد sporozoites الموجودة.لعزل وحساب sporozoites ، قم بإزالة رأس البعوض بعناية أثناء الضغط على الصدر بالملقط أو إبرة تشريح دقيقة. ستبقى الغدد اللعابية متصلة بالرأس الذي تمت إزالته. بعد ذلك ، قم بإزالة أي حطام إضافي للبعوض من الغدد اللعابية ووضعها في أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط تشريح البعوض.ثم قم بتعطيل الغدد اللعابية المعزولة عن طريق تمريرها عبر حقنة إبرة قياس 30 من 15 إلى 20 مرة ، وبعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من الغدد اللعابية المعطلة في وسائط تشريح البعوض في مقياس الدم والعد. أخيرا ، أعد تعليق الغدد اللعابية في التركيز المطلوب لوسائط تشريح البعوض أو PBS للحقن في الفئران أو الحفظ بالتبريد على المدى الطويل. مثل الصور المجهرية التي تصور P.berghei schizont الناضجة وغير الناضجة في ثقافات دم الفأر المتطفلة.مثل الصور المجهرية لرأس البعوض مع الغدد اللعابية لا تزال سليمة أثناء التشريح ، وتظهر الغدة اللعابية المشرحة تحت التكبير السفلي والأعلى. يشير توليد إشارة مضان خضراء في PB ، GFP 11 المصابة HEPA GFP من واحد إلى 10 خلايا مضيفة إلى تحلل الفجوة الطفيلية. من المهم إزالة طبقة الكرسي بعناية دون تعطيل واجهة التدرج.أيضا ، يتطلب الأمر القليل من الممارسة لإزالة الغدد اللعابية بشكل موثوق مع الرأس أثناء عزل الجراثيم الخفيفة. بعد العزل ، يمكن حفظ الأسبوروزويتات المعدلة وراثيا بالتبريد أو استخدامها طازجة في دراسات العدوى في الجسم الحي أو في المختبر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

المستحث الطفيلي قيادة وراثيا القلب المناعة الذاتية ومرض شاغاس في نموذج الدجاج

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

في تقييم فيفو من القوارض المتصورة الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em&gt; المتصورة</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...