Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية MOST 111-2311-B-001-019-MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان.

1. تحضير الخلايا التي تعبر عن diKillerRed أو البروتينات ذاتية الوسم (SLPs) في تجويف البيروكسيسوم
<ol><li>بذر الخلايا المرغوبة على أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي. بالنسبة للتجربة هنا ، قم بالبذور 2 × 105 خلايا SHSY5Y بشرية في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM / F-12 مكمل بمصل بقري جنيني بن?...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

يوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل pexophagy بوساطة Stub1 داخل مزارع الخلايا عن طريق رفع مستويات ROS البيروكسيسومال بالضوء. نظرا لأن البروتوكول يعتمد على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة ، يحتاج المرء إلى ضمان التعبير الكافي عن diKillerRed-VKSKL أو تلطيخ ليجند SLP المسمى بالصبغة داخل الخلايا مح...

البيروكسيسومات عضيات أحادية الغشاء موجودة في معظم الخلايا الحقيقية النواة. البيروكسيسومات هي حجرة استقلابية ضرورية لتنفيذ أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة ، وهدم البيورين ، وتخليق فوسفوليبيد الأثيروحمض الصفراء 1. يتحكم الأسيتيل CoA المشتق من البيروكسيسوم في توازن الدهون عن طريق تنظيم الإشارات المركزية في التمثيل الغذائي2. لذلك ، ليس من المستغرب أن وظائف البيروكسيسومال المعرضة للخطر متضمنة في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة والسرطانات والسمنة والسكري3،4،5. عملية أساسية في الحفاظ على عملية peroxisomal هي pexophagy. Pexophagy هي عملية تقويضية للدوران الانتقائي للبيروكسيسومات عن طريق الالتهام الذاتي. تستخدم الخلايا pexophagy للمساعدة في التحكم في كمية ونوعية البيروكسيسومات ، وبالتالي ضمان وظيفة بيروكسيسومال المناسبة. أظهرت دراسة حديثة أن فقدان البيروكسيسوم الناجم عن الطفرات في عوامل التكوين الحيوي البيروكسيسومالي PEX1 1 و 6 ينتج عن pexophagy6 غير المنضبط. والجدير بالذكر أن 65٪ من جميع مرضى اضطراب التكوين الحيوي البيروكسيسوم (PBD) يعانون من نقص في مركب ATPase AAA البيروكسيسومالي ، المكون من PEX1 و PEX6 و PEX26 في خلايا الثدييات7.
يمكن استخدام عدد من الطرق لبدء ودراسة pexophagy. في الخميرة ، يتم تشغيل pexophagy عندما يتم تحويل العناصر الغذائية الموردة من مصادر الكربون المعتمدة على البيروكسيسوم إلى مصادر الكربون المستقلة عن البيروكسيسوم (لخفض أعداد البيروكسيسوم الخلوية)8. على سبيل المثال ، يؤدي نقل خلايا Pichia pastoris المزروعة بالميثانول من وسط الميثانول إلى وسط الجلوكوز ووسط الإيثانول إلى تحفيز micropexophagy و macropexophagy ، على التوالي8،9،10. قامت عوازل micropexophagy بتجميع البيروكسيسومات للتحلل عن طريق إعادة تشكيل الفجوة لتشكيل أغشية عزل فراغية تشبه الكوب وهيكل يشبه الغطاء يسمى جهاز الغشاء الخاص بالميكروبيكسوفاجي (MIPA). في macropexophagy ، يتم غمر البيروكسيسومات الفردية بواسطة هياكل غشاء مزدوج تعرف باسم pexophagosomes ، تليها الانصهار مع الفجوة للتحلل8،9،10. تعد فسفرة مستقبلات pexophagy ، مثل Atg36p في Saccharomyces cerevisiae و Atg30p في Pichia pastoris ، أمرا بالغ الأهمية للمستقبلات لتوظيف آلات الالتهام الذاتي الأساسية وتسهيل استهداف البيروكسيسومال للجسيمات الذاتية 8,11.
في خلايا الثدييات ، يمكن أن يحدث pexophagy عن طريق الوجود في كل مكان. وضع علامات على بروتينات الغشاء البيروكسيسومالي PMP34 أو PEX3 مع يوبيكويتين على الجانب الخلوي يحفز pexophagy12. يؤدي الإفراط في التعبير عن PEX3 إلى انتشار البيروكسيسوم في كل مكان والتخلص من البيروكسيسوم بواسطة الجسيمات الحالة13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج PEX5 مع EGFP الطرفي C يضعف تصدير PEX5 أحادي الكل وينتج عنه pexophagy14. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا تشغيل pexophagy عن طريق علاج H 2 O2. تنتج البيروكسيسومات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ؛ على وجه التحديد ، لا ينتج إنزيم بيروكسيسومال Acox1 ، الذي يحفز الخطوة الأولى من أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة (> 22 كربون) ، ليس فقط أسيتيل-CoA ولكن أيضا بيروكسيسومال ROS. استجابة لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية المرتفعة تحت علاج H 2O2 ، تقوم خلايا الثدييات بتنشيط pexophagy لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وتخفيف التوتر. تم الإبلاغ عن أن علاج H 2O2 يدفع تجنيد الرنح وتوسع الشعيرات المتحور (ATM) إلى البيروكسيسومات. ثم يقوم ATM بفسفرة PEX5 لتعزيز دوران البيروكسيسومال بواسطة pexophagy15.
نظرا لأن البيروكسيسومات هي مراكز مولدة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فهي أيضا عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تجبر إصابات البيروكسيسومال المستحثة ب ROS الخلايا على تنشيط pexophagy لبدء مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم (إزالة البيروكسيسوم التالف عن طريق الالتهام الذاتي). هنا ، نحدد نهجا للتسبب عند الطلب لإصابة بيروكسيسومال المستحثة ب ROS. يستفيد البروتوكول من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء داخل العضيات16،17،18،19،20 (الشكل 1). يتم إضاءة البيروكسيسومات ذات العلامات الصبغية ، مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل تجويف البيروكسيسومال ، والذي يؤدي على وجه التحديد إلى إصابة البيروكسيسومالي. باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين. تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد ubiquitin E3 ligase Stub1 للسماح بابتلاعها في البلعمة الذاتية لإزالتها الفردية بواسطة pexophagy16. يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لمقارنة مصير البيروكسيسومات المصابة والصحية داخل نفس الخلية عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإتلاف جميع البيروكسيسومات (في جميع الخلايا) على طبق الاستزراع عالميا ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي لمسار pexophagy.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

يمكن لخلايا الثدييات أن تقلب البيروكسيسومات من خلال البكسوفاجي بوساطة Stub1. من المحتمل أن يسمح المسار بالتحكم الخلوي في كمية ونوعية البيروكسيسومات. خلال هذه العملية ، ينتقل بروتين الصدمة الحرارية 70 و ubiquitin E3 ligase ، Stub1 ، إلى البيروكسيسومات ليتم قلبها لبدء pexophagy. يسمح نشاط Stub1 ligase بتراكم يوبيكويتين والوحدات الأخرى المتعلقة بالالتهام الذاتي على البيروكسيسومات المستهدفة. يمكن أن يؤدي رفع مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) داخل تجويف البيروكسيسومال إلى تنشيط pexophagy بوساطة Stub1. لذلك ، يمكن للمرء استخدام توليد ROS بمساعدة الصبغة لتشغيل هذا المسار ومراقبته. توضح هذه المقالة إجراءات استخدام فئتين من الأصباغ ، البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية ، لبدء pexophagy داخل مزارع خلايا الثدييات. لا يمكن استخدام هذه البروتوكولات القائمة على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف جميع البيروكسيسومات داخل مجموعة الخلايا على مستوى العالم فحسب ، بل يمكن أن تسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة. نصف أيضا كيف يمكن متابعة pexophagy بوساطة Stub1 باستخدام مجهر الخلايا الحية.

يستفيد مخطط تحريض pexophagy بوساطة Stub1 الموضح هنا من توليد ROS بمساعدة الصبغة داخل تجويف البيروكسيسوم. تتطلب هذه العملية الحد الأدنى من شدة الضوء. وبالتالي ، يمكن إضاءة البيروكسيسومات التي تحتوي على بروتينات أو أصباغ فلورية باستخدام المجاهر البؤرية القياسية للمسح بالليزر. تؤدي الإضاءة البؤرية...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.

مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

تقوم البيروكسيسومات بأكسدة بيتا وهي عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تعامل الخلايا مع البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. لا يستخدم هذا البروتوكول فقط لاستهداف جميع البيروكسيسومات عالميا داخل مجموعة الخلايا ولكن يمكن أن يسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة.يمكن أيضا استخدام توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف العضيات خارج البيروكسيسومات لاستكشاف كيفية تعامل الخلايا مع إصابات العضيات. للبدء ، قم بزرع مرتين في 10 إلى خلايا SHSY5Y البشرية الخامسة أو ستة في 10 إلى خلايا NIH H3T3 للفأر الرابع في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع على أطباق استزراع ذات قاع زجاجي 35 ملم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 ملم. تنمو الخلايا تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا بالبلازميدات المرغوبة باستخدام كاشف النقل أو نقل الخلايا SHSY5Y. تمييع البلازميدات في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل وتخفيف ميكرولتر واحد من كاشف النقل في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل. الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف المخفف.تخلط بلطف وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف المركب إلى البئر الصغير 20 ملم المطلي مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا SHSY5Y بدون مضادات حيوية. هز الطبق برفق ذهابا وإيابا.قم بإجراء نقل خلايا NIH 3T3 كما هو موضح من قبل ولكن استبدل وسط المصل المخفض بدلا من DMEM / F-12 الخالي من المصل لتخفيف البلازميد وكاشف النقل. بعد ساعتين من النقل ، قم بإزالة الوسط المحتوي على كاشف النقل وأضف ملليلتر واحد من وسط الاستزراع الطازج. احتضان خلايا NIH 3T3 أو SHSY5Y عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء ، في غضون 24 ساعة بعد النقل ، قم بإزالة وسط الاستزراع وإضافة 10 ميكرولتر من 200 نانومولار HaloTag TMR ligand أو 200 نانومولار Janelia Fluor 646 HaloTag ligand على البئر الصغير الزجاجي 20 ملم. انقل الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون واتركه لمدة ساعة واحدة لتلطيخ الخلايا. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة وسط التلوين جيدا وأضف ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة.ضع طبقا ذو قاع زجاجي يحتوي على الخلايا المطلوبة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بحاضنة على سطح المسرح. في البرنامج ، انقر فوق نافذة الأداة ، واختر Optical ، وانقر فوق الزر DIA لتشغيل الضوء المرسل. اعرض الطبق من خلال عدسة المجهر واجعل الخلايا في بؤرة التركيز عن طريق تدوير مقبض التركيز.اختر LSM وانقر على زر تحديد كاشف الصبغة. انقر نقرا مزدوجا فوق الأصباغ المطلوبة في النافذة المنبثقة لتحديد إعدادات الليزر والمرشح المناسبة لتصوير الخلايا. انقر فوق Live4x في اللوحة الحية لبدء المسح السريع بالليزر لبدء فحص إشارات الفلورسنت للخلايا.حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم في عصا التحكم وحدد موقع الخلايا المتوسطة التي تعبر عن diKillerRed VKSKL أو SLP-VKSKL لتطبيق ضغط ROS على البيروكسيسومات. الحصول على صورة للخلية المطلوبة. انقر فوق نافذة الأداة واختر تحفيز LSM.ثم انقر فوق الزر الناقص وفي نافذة Live Image ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار يبلغ قطره 15 ميكرومتر يحتوي على البيروكسيسومات المرغوبة التي سيتم تطبيق ضغط ROS عليها. لتطبيق إجهاد ROS ، استخدم 561 نانومتر للخلايا التي تحتوي على ليجند SLP المسمى diKillerRed VKSKL أو TMR واستخدم 640 نانومتر للخلايا الملطخة ب Janelia Fluor 646 المسمى SLP ligand. حدد الطول الموجي لليزر لتطبيق إجهاد ROS.أدخل نسبة الليزر المطلوبة والمدة. لإنتاج ROS في البيروكسيسومات ، انقر فوق اكتساب ثم زر التحفيز لبدء المسح باستخدام 561 أو 640 نانومتر من الضوء من خلال عائد الاستثمار لمدة 30 ثانية لكل منهما. يتوافق هذا التحفيز مع ما يقرب من 5٪ من إعدادات طاقة الليزر ل 561 و 640 نانومتر.بعد 30 ثانية من إضاءة الليزر ، تفقد البيروكسيسومات داخل عائد الاستثمار إشارات diKillerRed VKSKL أو TMR أو Janelia Fluor 646. يسمح فقدان الإشارة هذا بتمييز البيروكسيسومات المضيئة وغير المضيئة داخل الخلية. لمراقبة الخلايا الحية للفيح، اتبع نقل Stub1 أو Hsp70 أو يوبيكويتين أو p62 أو LC3B الموسومات الموسومة ب EGFP إلى البيروكسيسومات المضيئة أو المجهدة ب ROS عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام فواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الإطارات.تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية كما هو موضح من قبل مراسل الفلورسنت roGFP2-VKSKL. تم التقاط صورة diKillerRed VKSKL بعد إجراء جميع قياسات roGFP2-VKSKL للإشارة إلى موقع البيروكسيسومات التالفة. تظهر البيانات أيضا أن البيروكسيسومات غير المضيئة لا تتأثر ، مما يشير إلى دقة المنهجية.تم استخدام هذه المنهجية لمراقبة pexophagy بوساطة Stub1. خلال هذه العملية ، يظهر Hsp70 و Stub1 والبروتينات المنتشرة في كل مكان ومحولات الالتهام الذاتي p62 و LC3B لاحقا في البيروكسيسومات المجهدة ب ROS لدفع pexophagy. باستخدام نفس الاستراتيجية ، كان من الممكن إتلاف جميع البيروكسيسومات في وقت واحد على طبق الاستزراع للتوصيف الكيميائي الحيوي ل pexophagy بوساطة Stub1.قبل إضاءة LED ، كان مضان EGFP-ubiquitin متجانسا في السيتوبلازم ولم يتزامن مع البيروكسيسومات. بعد تسع ساعات من إضاءة LED ، تراكمت إشارات EGFP-ubiquitin على جميع البيروكسيسومات في الخلايا المزروعة في طبق متحد البؤر. باستخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين.تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد يوبيكويتين E3 ligase Stub1 للسماح بإزالتها عن طريق pexophagy.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

أسلوب التصوير مع التعزيز ، Eyetracking ، والرصد الفسيولوجي

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

الهرمونات النباتية خلال رصد استجابات التوتر

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

رصد تأثيرات الوخز بالإبر في الدماغ بواسطة الرنين المغناطيسي الوظيفي الإنسان

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

اختبارات بيولوجية على مقاومة المبيدات الحشرية الرصد

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...