Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af et MOST 111-2311-B-001-019-MY3 forskningsstipendium fra National Science and Technology Council i Taiwan.

1. Fremstilling af celler, der udtrykker diKillerRed eller selvmærkende proteiner (SLP'er) i peroxisomlumen
<ol><li>Frø de ønskede celler på glasbundede cellekulturskåle. Til forsøget her sås 2 x 105 humane SHSY5Y-celler i 840 μL dyrkningsmedium (DMEM/F-12 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin) eller 6 x 104 NIH3T3-mus celler i 840 μL dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% bovint serum og 1% penicillin/streptomycin) på en 35 mm kulturskål...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Denne protokol beskriver, hvordan man udløser Stub1-medieret pexofagi i cellekulturer ved at hæve peroxisomale ROS-niveauer med lys. Da protokollen er afhængig af farvestofassisteret ROS-generering, skal man sikre tilstrækkeligt udtryk for diKillerRed-VKSKL eller farvestofmærket SLP-ligandfarvning i cellerne af interesse. I betragtning af at forskellige celletyper eller celler med forskellige genetiske baggrunde kan rumme peroxisomer med lidt forskellige egenskaber, kan det være nødvendigt at indstille de nøjagti...

Peroxisomer er enkeltmembranbundne organeller, der findes i de fleste eukaryote celler. Peroxisomer er et metabolisk rum, der er afgørende for at udføre beta-oxidation af meget langkædede fedtsyrer, purinkatabolisme og etherfosfolipid- og galdesyresyntese1. Peroxisomafledt acetyl-CoA styrer lipidhomeostase ved at regulere den centrale signalering i stofskiftet2. Derfor er det ingen overraskelse, at kompromitterede peroxisomale funktioner er underforstået i forskellige sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser, aldring, kræft, fedme og diabetes 3,4,5. En væsentlig proces i vedligeholdelsen af peroxisomal drift er pexophagy. Pexophagy er en katabolisk proces til selektiv omsætning af peroxisomer ved autofagi. Celler bruger pexofagi til at hjælpe med at kontrollere mængden og kvaliteten af peroxisomer og derved sikre korrekt peroxisomfunktion. En nylig undersøgelse viste, at peroxisomtab forårsaget af mutationer i PEX1 peroxisomal biogenese faktorer 1 og 6 skyldes ukontrolleret pexofagi6. Især har 65% af alle patienter med peroxisombiogeneseforstyrrelse (PBD) mangler i det peroxysomale AAA ATPase-kompleks, der består af PEX1, PEX6 og PEX26 i pattedyrceller7.
En række metoder kan bruges til at initiere og studere pexofagi. I gær udløses pexofagi, når de leverede næringsstoffer skiftes fra peroxisomafhængige kulstofkilder til peroxisomuafhængige kulstofkilder (til lavere cellulære peroxisomtal)8. For eksempel inducerer overførsel af methanoldyrkede Pichia-pastorisceller fra methanolmedium til glucosemedium og ethanolmedium henholdsvis mikropexophagi og makropexophagi henholdsvis 8,9,10. Micropexophagy sekvestrerede peroxisomer til nedbrydning ved at ombygge vakuolen til dannelse af koplignende vakuolære sekvestreringsmembraner og en låglignende struktur kaldet det mikropexophagy-specifikke membranapparat (MIPA). I makropexophagi opsluges individuelle peroxisomer af dobbeltmembranstrukturer kendt som pexophagosomer efterfulgt af fusion med vakuolen til nedbrydning 8,9,10. Fosforylering af pexofagireceptorer, såsom Atg36p i Saccharomyces cerevisiae og Atg30p i Pichia pastoris, er afgørende for, at receptorerne rekrutterer kerneautofagimaskiner og letter peroxisomal målretning mod autofagosomer 8,11.
I pattedyrceller kan pexophagy induceres ved ubiquitination. Mærkning af peroxisomale membranproteiner PMP34 eller PEX3 med ubiquitin på den cytosoliske side inducerer pexofagi12. Overekspressionen af PEX3 inducerer peroxisomubiquitination og peroxisomeliminering af lysosomer13. Desuden hæmmer fusionen af PEX5 med en C-terminal EGFP eksporten af monoubiquitineret PEX5 og resulterer i pexofagi14. På den anden side kan pexophagy også udløses afH2O2-behandling. Peroxisomer producerer reaktive iltarter (ROS); specifikt producerer det peroxysomale enzym Acox1, som katalyserer det indledende trin i beta-oxidation af meget langkædede fedtsyrer (> 22 carbon), ikke kun acetyl-CoA, men også peroxisomal ROS. Som reaktion på de forhøjede ROS-niveauer underH2O2-behandlingaktiverer pattedyrceller pexofagi for at sænke ROS-produktionen og lindre stress. Det er blevet rapporteret, atH2O2-behandlingdriver rekrutteringen af ataksi-telangiektasi muteret (ATM) til peroxisomer. ATM phosphorylerer derefter PEX5 for at fremme peroxisomomsætning ved pexofagi15.
Da peroxisomer er ROS-genererende centre, er de også tilbøjelige til ROS-skader. ROS-fremkaldte peroxysomale skader tvinger celler til at aktivere pexophagy for at indlede peroxisomkvalitetskontrolveje (fjernelse af det beskadigede peroxisom ved autofagi). Her skitserer vi en tilgang til on-demand udløsning af ROS-fremkaldt peroxisomal skade. Protokollen udnytter lysaktiveret ROS-produktion inden for organeller 16,17,18,19,20 (figur 1). Farvestofmærkede peroxisomer belyses, hvilket fører til ROS-produktion inden for det peroxysomale lumen, som specifikt udløser peroxisomal skade. Ved hjælp af denne protokol er det vist, at ROS-stressede peroxisomer fjernes gennem en ubiquitinafhængig nedbrydningsvej. ROS-stressede peroxisomer rekrutterer ubiquitin E3 ligase Stub1 for at tillade deres opslugning i autofagosomer til individuel fjernelse ved pexophagy16. Man kan bruge denne protokol til at sammenligne skæbnen for skadede og sunde peroxisomer i samme celle ved time-lapse mikroskopi. Metoden kan også bruges til globalt at beskadige alle peroxisomer (i alle celler) på en kulturskål, hvilket muliggør den biokemiske analyse af pexofagivejen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Pattedyrceller kan vende peroxisomer gennem Stub1-medieret pexofagi. Vejen tillader potentielt cellulær kontrol af mængden og kvaliteten af peroxisomer. Under denne proces translokerer varmechokprotein 70 og ubiquitin E3-ligasen, Stub1, på peroxisomer, der skal vendes om for at starte pexofagi. Stub1-ligaseaktiviteten tillader akkumulering af ubiquitin og andre autofagirelaterede moduler på målrettede peroxisomer. Forhøjelse af reaktive iltarter (ROS) niveauer inden for peroxisomal lumen kan aktivere Stub1-medieret pexofagi. Man kan derfor bruge farvestofassisteret ROS-generering til at udløse og overvåge denne vej. Denne artikel skitserer procedurerne for anvendelse af to klasser af farvestoffer, fluorescerende proteiner og syntetiske fluoroforer, til at indlede pexophagy inden for pattedyrcellekulturer. Disse farvestofassisterede ROS-generationsbaserede protokoller kan ikke kun bruges til at målrette mod alle peroxisomer inden for en cellepopulation globalt, men kan også tillade manipulation af individuelle peroxisomer inden for enkeltceller. Vi beskriver også, hvordan Stub1-medieret pexofagi kan følges ved hjælp af levende cellemikroskopi.

Det Stub1-medierede pexofaginduktionsskema vist her drager fordel af farvestofassisteret ROS-generering inden for peroxisomlumen. Denne operation kræver minimale lysintensiteter. Peroxisomer indeholdende fluorescerende proteiner eller farvestoffer kan derfor belyses ved hjælp af standard laserscanningskonfokale mikroskoper. Fokalbelysning fører til øjeblikkelig og lokaliseret ROS-produktion inden for individuelle peroxisomer, som angivet af fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL (figur 9)....

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Denne protokol indeholder instruktioner til udløsning og overvågning af Stub1-medieret pexophagy i levende celler.

Overvågning af stub1-medieret pexofagi

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroxisomer udfører betaoxidation og er tilbøjelige til ROS-skader. Denne metode gør det muligt at undersøge, hvordan celler håndterer ROS-stressede peroxisomer. Denne protokol bruges ikke kun til globalt at målrette alle peroxisomer inden for en cellepopulation, men kan også tillade manipulation af de enkelte peroxisomer inden for enkelte celler.Farvestofassisteret ROS-generering kan også bruges til at målrette organeller uden for peroxisomer for at undersøge, hvordan celler håndterer organelskader. Til at begynde med, frø to gange 10 til de femte humane SHSY5Y-celler eller seks gange 10 til den fjerde mus NIH H3T3-celler i 840 mikroliter kulturmedium på glasbundede 35 millimeter kulturskåle med en glasmikrobrønd med en diameter på 20 millimeter. Dyrk cellerne under 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius i 24 timer.Derefter transfekteres cellerne med ønskede plasmider ved anvendelse af et transfektionsreagens eller SHSY5Y-celletransfektion. Fortynd plasmider i 55 mikroliter serumfri DMEM / F-12 og fortynd en mikroliter transfektionsreagens i 55 mikroliter serumfri DMEM / F-12. Det fortyndede DNA kombineres med det fortyndede reagens.Bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt komplekset til 20 millimeter mikrobrønden, der tidligere er belagt med 100 mikroliter kulturmedium indeholdende SHSY5Y-celler uden antibiotika. Ryst forsigtigt fadet frem og tilbage.Udfør NIH 3T3-celletransfektion som vist før, men erstat reduceret serummedium i stedet for serumfri DMEM / F-12 til plasmidfortynding og transfektionsreagens. Efter to timers transfektion fjernes det transfektionsreagensholdige medium og tilsættes en milliliter frisk kulturmedium. Inkuber NIH 3T3- eller SHSY5Y-cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer.Til lysaktiveret ROS-produktion fjernes kulturmediet 24 timer efter transfektion, og der tilsættes 10 mikroliter 200 nanomolær HaloTag TMR-ligand eller 200 nanomolær Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand på 20 millimeter glasmikrobrønden. Overfør skålen til en 37 grader Celsius og 5% kuldioxidinkubator og lad den stå i en time for at plette cellerne. Efter en time fjernes farvningsmediet grundigt og tilsættes en milliliter frisk kulturmedium.Placer en glasbundet skål, der indeholder de ønskede celler, på et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med en stage-top inkubator. I softwaren skal du klikke på værktøjsvindue, vælge Okulært og klikke på DIA-knappen for at tænde det transmitterede lys. Se skålen gennem mikroskopets okular og bring cellerne i fokus ved at dreje fokusknappen.Vælg LSM og klik på knappen Dye Detector Select. Dobbeltklik på de ønskede farvestoffer i pop op-vinduet for at vælge de relevante laser- og filterindstillinger til billeddannelse af cellerne. Klik på Live4x i Live-panelet for at starte hurtig laserscanning for at starte screening for cellernes fluorescerende signaler.Flyt scenen rundt ved hjælp af joystick-controlleren, og find mediet diKillerRed VKSKL eller SLP-VKSKL-ekspressive celler for at anvende ROS-stress på peroxisomerne. Få et billede af den ønskede celle. Klik på værktøjsvindue, og vælg LSM-stimulering.Klik derefter på ellipseknappen, og brug musen i Live Image-vinduet til at tegne et ROI på 15 mikrometer i diameter, der indeholder de ønskede peroxisomer, som ROS-stress vil blive anvendt på. For at anvende ROS-stress skal du bruge 561 nanometer til celler med diKillerRed VKSKL eller TMR-mærket SLP-ligand og bruge 640 nanometer til celler farvet med Janelia Fluor 646-mærket SLP-ligand. Vælg laserbølgelængden til påføring af ROS-spændingen.Indtast den ønskede laserprocent og varigheden. For ROS-produktion i peroxisomerne skal du klikke på Anskaf og derefter på knappen Stimulering for at starte scanningen med 561 eller 640 nanometer lys gennem ROI'erne i 30 sekunder hver. Denne stimulering svarer til ca. 5% lasereffektindstillinger for 561 og 640 nanometer.Efter 30 sekunders laserbelysning mister peroxisomer inden for ROI'erne deres diKillerRed VKSKL-, TMR- eller Janelia Fluor 646-signaler. Dette signaltab gør det muligt at skelne mellem de oplyste og ikke-belyste peroxisomer i cellen. For at overvåge de levende celler i pexofagen skal du følge translokationen af EGFP-mærket Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 eller LC3B på de oplyste eller ROS-stressede peroxisomer ved tidsforløbsbilleddannelse ved hjælp af 10-minutters intervaller mellem rammer.Fokalbelysning fører til øjeblikkelig og lokaliseret ROS-produktion inden for individuelle peroxisomer som angivet af fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL. diKillerRed VKSK-billedet blev taget, efter at alle roGFP2-VKSK-målinger blev udført for at indikere de beskadigede peroxisomers placering. Dataene viser også, at ubelyste peroxisomer ikke påvirkes, hvilket indikerer metodens præcision.Denne metode blev brugt til at overvåge Stub1-medieret pexofagi. Under denne proces vises Hsp70, Stub1, ubiquitinerede proteiner, autofagiadaptere p62 og LC3B efterfølgende i ROS-stressede peroxisomer for at drive pexofagi. Ved hjælp af den samme strategi var det muligt samtidig at beskadige alle peroxisomerne på en kulturskål til den biokemiske karakterisering af Stub1-medieret pexofagi.Før LED-belysning var EGFP-ubiquitinfluorescens homogen i cytoplasmaet og colokaliserede ikke med peroxisomerne. Efter ni timers LED-belysning akkumulerede EGFP-ubiquitinsignalerne på alle peroxisomerne i cellerne dyrket i en konfokal skål. Ved hjælp af denne protokol fandt vi, at ROS-stressede peroxisomer fjernes gennem en ubiquitinafhængig nedbrydningsvej.ROS-stressede peroxisomer rekrutterer ubiquitin E3 ligase Stub1 for at tillade deres fjernelse ved pexophagy.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Koblede Analyser for Monitoring Proteingenfoldningstrin i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Påvisning af Intracellulær genekspression i levende celler af murine, Human og porcin oprindelse anvendelse af fluorescens-mærkede Nanopartikler

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...