Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
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Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de recherche MOST 111-2311-B-001-019-MY3 du Conseil national des sciences et de la technologie de Taïwan.

1. Préparation de cellules exprimant des protéines diKillerRed ou auto-marquantes (SLP) dans la lumière du peroxysome
<ol><li>Ensemencez les cellules désirées sur des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. Pour l’expérience ici, ensemencer 2 x 105 cellules SHSY5Y humaines dans 840 μL de milieu de culture (DMEM/F-12 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine) ou 6 x 104 cellules NIH3T3 de souris dans 840 μL de milieu de cult...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Ce protocole détaille comment déclencher la pexophagie médiée par Stub1 dans les cultures cellulaires en élevant les niveaux de ROS peroxysomaux avec de la lumière. Comme le protocole repose sur la génération de ROS assistée par colorant, il faut s’assurer d’une expression suffisante de la coloration du ligand SLP marqué par diKillerRed-VKSKL ou colorant dans les cellules d’intérêt. Étant donné que différents types de cellules ou de cellules de différents antécédents génétiques peuvent abriter d...

Les peroxysomes sont des organites à membrane unique présents dans la plupart des cellules eucaryotes. Les peroxysomes sont un compartiment métabolique essentiel pour effectuer la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne, le catabolisme purique, et la synthèse des phospholipides éthers et des acides biliaires1. L’acétyl-CoA dérivé du peroxysome contrôle l’homéostasie lipidique en régulant la signalisation centrale dans le métabolisme2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que des fonctions peroxysomiques compromises soient impliquées dans diverses maladies, notamment les troubles neurodégénératifs, le vieillissement, les cancers, l’obésité et le diabète 3,4,5. Un processus essentiel dans le maintien du fonctionnement peroxysomal est la pexophagie. La pexophagie est un processus catabolique pour le renouvellement sélectif des peroxysomes par autophagie. Les cellules utilisent la pexophagie pour aider à contrôler la quantité et la qualité des peroxysomes, assurant ainsi une fonction peroxysomale appropriée. Une étude récente a démontré que la perte de peroxysomes causée par des mutations des facteurs de biogenèse peroxysomale PEX1 1 et 6 résulte d’une pexophagie6 non contrôlée. Notamment, 65% de tous les patients atteints de trouble de biogenèse des peroxysomes (PBD) présentent des déficiences dans le complexe peroxysomal AAA ATPase, composé de PEX1, PEX6 et PEX26 dans les cellules de mammifères7.
Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour initier et étudier la pexophagie. Chez la levure, la pexophagie est déclenchée lorsque les nutriments fournis passent de sources de carbone dépendantes des peroxysomes à des sources de carbone indépendantes des peroxysomes (pour réduire le nombre de peroxysomes cellulaires)8. Par exemple, le transfert de cellules de Pichia pastoris cultivées au méthanol du milieu méthanol au milieu glucose et au milieu éthanol induit respectivement la micropexophagie et la macropexophagie, respectivement 8,9,10. La micropexophagie séquestre les peroxysomes regroupés pour les dégrader en remodelant la vacuole pour former des membranes de séquestration vacuolaire en forme de coupe et une structure en forme de couvercle appelée appareil membranaire spécifique à la micropexophagie (MIPA). Dans la macropexophagie, les peroxysomes individuels sont engloutis par des structures à double membrane appelées pexophagosomes, suivies d’une fusion avec la vacuole pour la dégradation 8,9,10. La phosphorylation des récepteurs de pexophagie, tels que Atg36p chez Saccharomyces cerevisiae et Atg30p chez Pichia pastoris, est essentielle pour que les récepteurs recrutent la machinerie autophagie centrale et facilitent le ciblage peroxysomal des autophagosomes 8,11.
Dans les cellules de mammifères, la pexophagie peut être induite par ubiquitination. Le marquage des protéines membranaires peroxysomiques PMP34 ou PEX3 avec de l’ubiquitine du côté cytosolique induit la pexophagie12. La surexpression de PEX3 induit l’ubiquitination des peroxysomes et l’élimination des peroxysomes par les lysosomes13. De plus, la fusion de PEX5 avec un EGFP C-terminal nuit à l’exportation de PEX5 monoubiquitiné et aboutit à la pexophagie14. D’autre part, la pexophagie peut également être déclenchée par un traitement H2O2. Les peroxysomes produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS); plus précisément, l’enzyme peroxysomale Acox1, qui catalyse l’étape initiale de la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne (carbone > 22), produit non seulement de l’acétyl-CoA mais aussi des ROS peroxysomaux. En réponse aux niveaux accrus de ROS sous traitement H2O2, les cellules de mammifères activent la pexophagie pour réduire la production de ROS et atténuer le stress. Il a été rapporté que le traitementH2O2entraîne le recrutement de l’ataxie-télangiectasie mutée (ATM) en peroxysomes. ATM phosphoryle ensuite PEX5 pour favoriser le renouvellement peroxysomal par pexophagie15.
Étant donné que les peroxysomes sont des centres générateurs de ROS, ils sont également sujets aux dommages causés par les ROS. Les lésions peroxysomiques provoquées par les ROS forcent les cellules à activer la pexophagie pour initier des voies de contrôle de la qualité des peroxysomes (élimination du peroxysome endommagé par autophagie). Ici, nous décrivons une approche pour le déclenchement à la demande de lésions peroxysomiques provoquées par les ROS. Le protocole tire parti de la production de ROS activées par la lumière dans les organites 16,17,18,19,20 (Figure 1). Les peroxysomes marqués au colorant sont éclairés, ce qui entraîne la production de ROS dans la lumière peroxysomale, ce qui déclenche spécifiquement des lésions peroxysomales. En utilisant ce protocole, il est démontré que les peroxysomes soumis à un stress ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine. Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur immersion dans les autophagosomes pour leur élimination individuelle par pexophagie16. On peut utiliser ce protocole pour comparer le sort des peroxysomes blessés et sains dans la même cellule par microscopie accélérée. La méthode peut également être utilisée pour endommager globalement tous les peroxysomes (dans toutes les cellules) sur une boîte de culture, permettant l’analyse biochimique de la voie pexophagie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Les cellules de mammifères peuvent retourner les peroxysomes par pexophagie médiée par Stub1. La voie permet potentiellement le contrôle cellulaire de la quantité et de la qualité des peroxysomes. Au cours de ce processus, la protéine de choc thermique 70 et l’ubiquitine E3 ligase, Stub1, se transloquent sur les peroxysomes pour être retournés pour initier la pexophagie. L’activité de la ligase Stub1 permet l’accumulation d’ubiquitine et d’autres modules liés à l’autophagie sur des peroxysomes ciblés. L’élévation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière peroxysomale peut activer la pexophagie médiée par Stub1. On peut donc utiliser la génération de ROS assistée par colorant pour déclencher et surveiller cette voie. Cet article décrit les procédures d’utilisation de deux classes de colorants, les protéines fluorescentes et les fluorophores synthétiques, pour initier la pexophagie dans les cultures de cellules de mammifères. Ces protocoles basés sur la génération de ROS assistés par colorant peuvent non seulement être utilisés pour cibler tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire à l’échelle mondiale, mais peuvent également permettre la manipulation de peroxysomes individuels dans des cellules individuelles. Nous décrivons également comment la pexophagie médiée par Stub1 peut être suivie à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.

Le schéma d’induction de la pexophagie médiée par Stub1 illustré ici tire parti de la génération de ROS assistée par colorant dans la lumière du peroxysome. Cette opération nécessite des intensités lumineuses minimales. Les peroxysomes contenant des protéines fluorescentes ou des colorants peuvent donc être éclairés à l’aide de microscopes confocaux standard à balayage laser. L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiq...

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Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Ce protocole fournit des instructions pour déclencher et surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules vivantes.

Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Les peroxysomes effectuent une oxydation bêta et sont sujets aux dommages causés par les ROS. Cette méthode permet d’étudier comment les cellules traitent les peroxysomes stressés par les ROS. Ce protocole n’est pas seulement utilisé pour cibler globalement tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire, mais peut également permettre la manipulation des peroxysomes individuels dans des cellules individuelles.La génération de ROS assistée par colorant peut également être utilisée pour cibler les organites en dehors des peroxysomes afin de sonder la façon dont les cellules traitent les lésions des organites. Pour commencer, semer deux fois 10 à la cinquième cellule SHSY5Y humaine ou six fois 10 à la quatrième souris NIH H3T3 cellules dans 840 microlitres de milieu de culture sur des boîtes de culture de 35 millimètres à fond de verre avec un micropuits en verre de 20 millimètres de diamètre. Cultivez les cellules sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Ensuite, transfectez les cellules avec les plasmides souhaités à l’aide d’un réactif de transfection ou d’une transfection cellulaire SHSY5Y. Diluer les plasmides dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum et diluer un microlitre de réactif de transfection dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum. Combinez l’ADN dilué avec le réactif dilué.Mélanger délicatement et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ajouter le complexe au micropuits de 20 millimètres préalablement plaqué avec 100 microlitres de milieu de culture contenant des cellules SHSY5Y sans antibiotiques. Secouez doucement le plat d’avant en arrière.Effectuer la transfection cellulaire NIH 3T3 comme démontré précédemment, mais remplacer le milieu sérique réduit par le DMEM/F-12 sans sérum par le réactif de dilution plasmidique et de transfection. Après deux heures de transfection, retirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais. Incuber les cellules NIH 3T3 ou SHSY5Y à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.Pour la production de ROS activés par la lumière, 24 heures après la transfection, retirez le milieu de culture et ajoutez 10 microlitres de ligand HaloTag TMR 200 nanomolaires ou 200 nanomolaires Janelia Fluor 646 HaloTag ligand sur le micropuits en verre de 20 millimètres. Transférez la capsule dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et laissez-la pendant une heure pour colorer les cellules. Après une heure, retirez soigneusement le milieu de coloration et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais.Placez une antenne à fond de verre contenant les cellules souhaitées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’un incubateur à étage. Dans le logiciel, cliquez sur Fenêtre d’outil, choisissez Oculaire et cliquez sur le bouton DIA pour allumer la lumière transmise. Visualisez l’antenne parabolique à travers l’oculaire du microscope et mettez les cellules au point en tournant le bouton de mise au point.Choisissez LSM et cliquez sur le bouton Colore Detector Select (Sélectionner un détecteur de colorant). Double-cliquez sur les colorants souhaités dans la fenêtre contextuelle pour sélectionner les paramètres de laser et de filtre appropriés pour l’imagerie des cellules. Cliquez sur Live4x dans le panneau Live pour lancer un balayage laser rapide afin de commencer à filtrer les signaux fluorescents des cellules.Déplacez la scène à l’aide du contrôleur du joystick et localisez les cellules exprimant le milieu diKillerRed VKSKL ou SLP-VKSKL pour appliquer une contrainte ROS sur les peroxysomes. Acquérir une image de la cellule souhaitée. Cliquez sur Fenêtre d’outil et choisissez LSM Stimulation.Cliquez ensuite sur le bouton ellipse et dans la fenêtre Live Image, utilisez la souris pour dessiner un ROI de 15 micromètres de diamètre contenant les peroxysomes souhaités auxquels la contrainte ROS sera appliquée. Pour appliquer une contrainte ROS, utilisez 561 nanomètres pour les cellules avec le ligand diKillerRed VKSKL ou SLP marqué TMR et utilisez 640 nanomètres pour les cellules colorées avec le ligand SLP marqué Janelia Fluor 646. Sélectionnez la longueur d’onde laser pour appliquer la contrainte ROS.Entrez le pourcentage laser souhaité et la durée. Pour la production de ROS dans les peroxysomes, cliquez sur Acquérir puis sur le bouton Stimulation pour lancer le balayage avec 561 ou 640 nanomètres de lumière à travers les ROI pendant 30 secondes chacun. Cette stimulation correspond à des réglages de puissance laser d’environ 5% pour 561 et 640 nanomètres.Après 30 secondes d’éclairage laser, les peroxysomes dans les ROI perdent leurs signaux diKillerRed VKSKL, TMR ou Janelia Fluor 646. Cette perte de signal permet de distinguer les peroxysomes éclairés et non éclairés à l’intérieur de la cellule. Pour surveiller les cellules vivantes pexophages, suivez la translocation de Stub1, Hsp70, ubiquitine, p62 ou LC3B marqués EGFP sur les peroxysomes éclairés ou stressés par ROS par imagerie accélérée en utilisant des intervalles de 10 minutes entre les images.L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiqué par le rapporteur fluorescent roGFP2-VKSKL. L’image diKillerRed VKSKL a été prise après que toutes les mesures roGFP2-VKSKL aient été effectuées pour indiquer l’emplacement des peroxysomes endommagés. Les données montrent également que les peroxysomes non éclairés ne sont pas affectés, ce qui indique la précision de la méthodologie.Cette méthodologie a été utilisée pour surveiller la pexophagie médiée par Stub1. Au cours de ce processus, Hsp70, Stub1, les protéines ubiquitinées, les adaptateurs d’autophagie p62 et LC3B apparaissent par la suite dans les peroxysomes stressés par les ROS pour entraîner la pexophagie. En utilisant la même stratégie, il a été possible d’endommager simultanément tous les peroxysomes sur une boîte de culture pour la caractérisation biochimique de la pexophagie médiée par Stub1.Avant l’éclairage LED, la fluorescence EGFP-ubiquitine était homogène dans le cytoplasme et ne colocalisait pas avec les peroxysomes. Après neuf heures d’éclairage LED, les signaux EGFP-ubiquitine se sont accumulés sur tous les peroxysomes dans les cellules cultivées dans une boîte confocale. En utilisant ce protocole, nous avons constaté que les peroxysomes stressés par les ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine.Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur élimination par pexophagie.

Research

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Recherche

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