Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Forschungsstipendium MOST 111-2311-B-001-019-MY3 des National Science and Technology Council in Taiwan unterstützt.

1. Präparation von Zellen, die diKillerRed oder selbstmarkierende Proteine (SLPs) im Peroxisomlumen exprimieren
<ol><li>Säen Sie die gewünschten Zellen auf Zellkulturschalen mit Glasboden. Für das hier durchgeführte Experiment werden 2 x 105 humane SHSY5Y-Zellen in 840 μl Nährmedium (DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) oder 6 x 104 NIH3T3-Mäusezellen in 840 μl Nährmedium (DMEM ergänzt mit 10 % Kälberserum und 1 % Penicilli...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in Zellkulturen ausgelöst werden kann, indem der peroxisomale ROS-Spiegel mit Licht erhöht wird. Da das Protokoll auf farbstoffgestützter ROS-Generierung beruht, muss eine ausreichende Expression von diKillerRed-VKSKL oder farbstoffmarkierten SLP-Liganden in den interessierenden Zellen sichergestellt werden. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen oder Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund Peroxisomen mit leicht unterschiedlichen...

Peroxisomen sind an eine einzelne Membran gebundene Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorkommen. Peroxisomen sind ein metabolisches Kompartiment, das für die Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren, den Purinkatabolismus und die Synthese von Etherphospholipiden und Gallensäuren unerlässlichist 1. Peroxisom-abgeleitetes Acetyl-CoA steuert die Lipidhomöostase, indem es die zentrale Signalübertragung im Stoffwechselreguliert 2. Daher ist es nicht verwunderlich, dass beeinträchtigte peroxisomale Funktionen bei verschiedenen Krankheiten impliziert sind, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Alterung, Krebs, Fettleibigkeit und Diabetes 3,4,5. Ein wesentlicher Prozess bei der Aufrechterhaltung der peroxisomalen Operation ist die Pexophagie. Die Pexophagie ist ein kataboler Prozess für den selektiven Umsatz von Peroxisomen durch Autophagie. Zellen nutzen die Pexophagie, um die Quantität und Qualität der Peroxisomen zu kontrollieren und so eine ordnungsgemäße peroxisomale Funktion zu gewährleisten. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass der Peroxisomverlust, der durch Mutationen in den peroxisomalen PEX1-Biogenesefaktoren 1 und 6 verursacht wird, auf eine unkontrollierte Pexophagie zurückzuführenist 6. Bemerkenswert ist, dass 65 % aller Patienten mit Peroxisom-Biogenese-Störung (PBD) einen Mangel im peroxisomalen AAA-ATPase-Komplex aufweisen, der in Säugetierzellen aus PEX1, PEX6 und PEX26 besteht7.
Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Pexophagie zu initiieren und zu untersuchen. In Hefe wird die Pexophagie ausgelöst, wenn die zugeführten Nährstoffe von peroxisomabhängigen Kohlenstoffquellen auf peroxisomunabhängige Kohlenstoffquellen umgestellt werden (um die zelluläre Peroxisomzahl zu senken)8. Zum Beispiel induziert der Transfer von Methanol-gezüchteten Pichia pastoris-Zellen von Methanolmedium auf Glukosemedium und Ethanolmedium Mikropexophagie bzw. Makropexophagie 8,9,10. Mikropexophagie sequestrierte gruppierte Peroxisomen für den Abbau, indem sie die Vakuole umbauten, um becherartige vakuoläre Sequestrierungsmembranen und eine deckelartige Struktur zu bilden, die als Mikropexophagie-spezifischer Membranapparat (MIPA) bezeichnet wird. Bei der Makropexophagie werden einzelne Peroxisomen von Doppelmembranstrukturen, den sogenannten Pexophagosomen, umhüllt, gefolgt von einer Fusion mit der Vakuole zum Abbau 8,9,10. Die Phosphorylierung von Pexophagierezeptoren, wie Atg36p in Saccharomyces cerevisiae und Atg30p in Pichia pastoris, ist entscheidend für die Rezeptoren, um die zentrale Autophagie-Maschinerie zu rekrutieren und das peroxisomale Targeting auf Autophagosomen zu erleichtern 8,11.
In Säugetierzellen kann Pexophagie durch Ubiquitinierung induziert werden. Die Markierung der peroxisomalen Membranproteine PMP34 oder PEX3 mit Ubiquitin auf der zytosolischen Seite induziert eine Pexophagie12. Die Überexpression von PEX3 induziert Peroxisom-Ubiquitinierung und Peroxisom-Eliminierung durch Lysosomen13. Darüber hinaus beeinträchtigt die Fusion von PEX5 mit einem C-terminalen EGFP den Export von monoubiquitiniertem PEX5 und führt zu einer Pexophagie14. Andererseits kann die Pexophagie auch durch eineH2O2-Behandlungausgelöst werden. Peroxisomen produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS); Insbesondere das peroxisomale Enzym Acox1, das den ersten Schritt der Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren (> 22-Kohlenstoff) katalysiert, produziert nicht nur Acetyl-CoA, sondern auch peroxisomales ROS. Als Reaktion auf die erhöhten ROS-Werte unter H2O2-Behandlungaktivieren Säugetierzellen die Pexophagie, um die ROS-Produktion zu senken und Stress abzubauen. Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit H 2 O2die Rekrutierung von Ataxie-Teleangiektasie-mutierten (ATM) zu Peroxisomen vorantreibt. ATM phosphoryliert dann PEX5, um den peroxisomalen Umsatz durch Pexophagie zu fördern15.
Da Peroxisomen ROS-erzeugende Zentren sind, sind sie auch anfällig für ROS-Schäden. ROS-induzierte peroxisomale Verletzungen zwingen die Zellen, die Pexophagie zu aktivieren, um Peroxisom-Qualitätskontrollwege zu initiieren (Entfernung des beschädigten Peroxisoms durch Autophagie). In dieser Arbeit skizzieren wir einen Ansatz für die On-Demand-Auslösung von ROS-induzierten peroxisomalen Verletzungen. Das Protokoll macht sich die lichtaktivierte ROS-Produktion in den Organellen 16,17,18,19,20 zunutze (Abbildung 1). Farbstoffmarkierte Peroxisomen werden beleuchtet, was zu einer ROS-Produktion im peroxisomalen Lumen führt, die spezifisch eine peroxisomale Schädigung auslöst. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden. ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, damit sie in Autophagosomen einfließen können, um sie durch Pexophagie einzeln entfernenzu können 16. Man kann dieses Protokoll verwenden, um das Schicksal von verletzten und gesunden Peroxisomen innerhalb derselben Zelle durch Zeitraffermikroskopie zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, um alle Peroxisomen (in allen Zellen) auf einer Kulturschale global zu schädigen, was die biochemische Analyse des Pexophagie-Signalwegs ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Säugetierzellen können Peroxisomen durch Stub1-vermittelte Pexophagie umwandeln. Der Signalweg ermöglicht möglicherweise die zelluläre Kontrolle der Quantität und Qualität von Peroxisomen. Während dieses Prozesses translozieren das Hitzeschockprotein 70 und die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1 auf Peroxisomen, die umgedreht werden, um die Pexophagie zu initiieren. Die Aktivität der Stub1-Ligase ermöglicht die Akkumulation von Ubiquitin und anderen Autophagie-relevanten Modulen auf gezielten Peroxisomen. Eine Erhöhung des Spiegels der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im peroxisomalen Lumen kann die Stub1-vermittelte Pexophagie aktivieren. Man kann daher die farbstoffgestützte ROS-Generierung nutzen, um diesen Signalweg auszulösen und zu überwachen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Verwendung von zwei Klassen von Farbstoffen, fluoreszierenden Proteinen und synthetischen Fluorophoren, um die Pexophagie in Säugetierzellkulturen zu initiieren. Diese farbstoffgestützten Protokolle, die auf der ROS-Generierung basieren, können nicht nur verwendet werden, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation weltweit anzusprechen, sondern können auch die Manipulation einzelner Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen. Wir beschreiben auch, wie die Stub1-vermittelte Pexophagie mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie verfolgt werden kann.

Das hier gezeigte Stub1-vermittelte Pexophagie-Induktionsschema nutzt die Vorteile der farbstoffgestützten ROS-Generierung innerhalb des Peroxisomlumens. Dieser Vorgang erfordert minimale Lichtintensitäten. Peroxisomen, die fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe enthalten, können daher mit handelsüblichen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen beleuchtet werden. Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zei...

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Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.

Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroxisomen führen Beta-Oxidation durch und sind anfällig für ROS-Schäden. Mit dieser Methode kann untersucht werden, wie Zellen mit ROS-gestressten Peroxisomen umgehen. Dieses Protokoll wird nicht nur verwendet, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation global anzusprechen, sondern kann auch die Manipulation der einzelnen Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen.Die farbstoffgestützte ROS-Generierung kann auch verwendet werden, um Organellen außerhalb von Peroxisomen anzusprechen, um zu untersuchen, wie Zellen mit Organellenverletzungen umgehen. Zu Beginn werden zwei mal 10 bis fünfte menschliche SHSY5Y-Zellen oder sechs mal 10 bis vierte NIH H3T3-Zellen der Maus in 840 Mikrolitern Nährmedium auf 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden und einer Glasmikrovertiefung mit einem Durchmesser von 20 Millimetern ausgesät. Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang unter 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.Als nächstes transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Plasmiden mit einem Transfektionsreagenz oder einer SHSY5Y-Zelltransfektion. Verdünnen Sie die Plasmide in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12 und verdünnen Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Reagenz.Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie den Komplex in das 20-Millimeter-Mikroloch, das zuvor mit 100 Mikrolitern Nährmedium beschichtet wurde, das SHSY5Y-Zellen ohne Antibiotika enthält. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig hin und her.Führen Sie die NIH 3T3-Zelltransfektion wie zuvor gezeigt durch, ersetzen Sie jedoch reduziertes Serummedium anstelle von serumfreiem DMEM/F-12 für die Plasmidverdünnung und das Transfektionsreagenz. Entfernen Sie nach zwei Stunden Transfektion das transfektionsreagenzienhaltige Medium und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu. Inkubieren Sie die NIH 3T3- oder SHSY5Y-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.Für die lichtaktivierte ROS-Produktion entfernen Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Nährmedium und geben 10 Mikroliter des 200 nanomolaren HaloTag TMR-Liganden oder 200 nanomolaren Janelia Fluor 646 HaloTag-Liganden auf das 20-Millimeter-Glasmikroloch. Übertragen Sie die Schale in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lassen Sie sie eine Stunde lang stehen, um die Zellen zu färben. Entfernen Sie nach einer Stunde das Färbemedium gründlich und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu.Stellen Sie eine Schale mit Glasboden und den gewünschten Zellen auf ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist. Klicken Sie in der Software auf Werkzeugfenster, wählen Sie Okular und klicken Sie auf die DIA-Schaltfläche, um das übertragene Licht einzuschalten. Betrachten Sie die Schüssel durch das Mikroskopokular und bringen Sie die Zellen durch Drehen des Fokusknopfes in den Fokus.Wählen Sie LSM und klicken Sie auf die Schaltfläche Dye Detector Select. Doppelklicken Sie im Pop-up-Fenster auf die gewünschten Farbstoffe, um die entsprechenden Laser- und Filtereinstellungen für die Abbildung der Zellen auszuwählen. Klicken Sie im Live-Panel auf Live4x, um ein schnelles Laserscanning zu starten, um das Screening nach den Fluoreszenzsignalen der Zellen zu starten.Bewegen Sie den Tisch mit dem Joystick-Controller und lokalisieren Sie die medialen diKillerRed VKSKL- oder SLP-VKSKL-exprimierenden Zellen, um ROS-Stress auf die Peroxisomen auszuüben. Erfassen Sie ein Bild der gewünschten Zelle. Klicken Sie auf Tool-Fenster und wählen Sie LSM-Stimulation.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ellipse und zeichnen Sie im Livebild-Fenster mit der Maus einen ROI von 15 Mikrometern Durchmesser, der die gewünschten Peroxisomen enthält, auf die ROS-Spannung angewendet wird. Um ROS-Stress auszuüben, verwenden Sie 561 Nanometer für Zellen mit dem diKillerRed VKSKL- oder TMR-markierten SLP-Liganden und 640 Nanometer für Zellen, die mit dem Janelia Fluor 646-markierten SLP-Liganden gefärbt sind. Wählen Sie die Laserwellenlänge für die Aufbringung der ROS-Spannung.Geben Sie den gewünschten Laserprozentsatz und die Dauer ein. Für die ROS-Produktion in den Peroxisomen klicken Sie auf Erfassen und dann auf die Schaltfläche Stimulation, um die Abtastung mit 561 oder 640 Nanometern Licht durch die ROIs für jeweils 30 Sekunden zu starten. Diese Stimulation entspricht ca. 5% Laserleistungseinstellungen für 561 und 640 Nanometer.Nach 30 Sekunden Laserbeleuchtung verlieren Peroxisomen innerhalb der ROIs ihre diKillerRed VKSKL-, TMR- oder Janelia Fluor 646-Signale. Dieser Signalverlust ermöglicht die Unterscheidung zwischen beleuchteten und unbeleuchteten Peroxisomen innerhalb der Zelle. Um die lebenden Zellen der Pexophagen zu überwachen, verfolgen Sie die Translokation von EGFP-markierten Stub1, Hsp70, Ubiquitin, p62 oder LC3B auf die beleuchteten oder ROS-gestressten Peroxisomen durch Zeitrafferaufnahmen in 10-Minuten-Intervallen zwischen den Bildern.Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt. Das diKillerRed VKSKL-Bild wurde aufgenommen, nachdem alle roGFP2-VKSKL-Messungen durchgeführt wurden, um die Position der beschädigten Peroxisomen anzuzeigen. Die Daten zeigen auch, dass unbeleuchtete Peroxisomen nicht betroffen sind, was auf die Präzision der Methodik hinweist.Diese Methodik wurde verwendet, um die Stub1-vermittelte Pexophagie zu überwachen. Während dieses Prozesses treten Hsp70, Stub1, ubiquitinierte Proteine, Autophagie-Adapter p62 und LC3B in ROS-gestressten Peroxisomen auf, um die Pexophagie anzutreiben. Mit der gleichen Strategie war es möglich, alle Peroxisomen auf einer Kulturschale gleichzeitig zu schädigen, um die Stub1-vermittelte Pexophagie biochemisch zu charakterisieren.Vor der LED-Beleuchtung war die EGFP-Ubiquitin-Fluoreszenz im Zytoplasma homogen und kolokalisierte nicht mit den Peroxisomen. Nach neun Stunden LED-Beleuchtung akkumulierten sich die EGFP-Ubiquitin-Signale auf allen Peroxisomen in den Zellen, die in einer konfokalen Schale gezüchtet wurden. Mit Hilfe dieses Protokolls fanden wir heraus, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden.ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, um sie durch Pexophagie entfernen zu können.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

Funktionelle Bildgebung mit Verstärkung, Eyetracking und Physiologische Überwachung

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Überwachung Pflanzenhormone bei Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Überwachung Akupunktur Effects on Human Brain von fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

Bioassays zur Überwachung Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...