Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מחקר MOST 111-2311-B-001-019-MY3 מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן.

1. הכנת תאים המבטאים diKillerRed או חלבוני תיוג עצמי (SLPs) בלומן הפרוקסיזום
<ol><li>זרעו את התאים הרצויים על צלחות תרבית תאים בעלות תחתית זכוכית. לצורך הניסוי כאן, זרעו 2 x 105 תאי SHSY5Y אנושיים ב-840 מיקרוליטר של מדיום תרבית (DMEM/F-12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) או 6 x 104<...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה מפרט כיצד להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתוך תרביות תאים על ידי העלאת רמות ROS פרוקסיזומליות עם אור. מכיוון שהפרוטוקול מסתמך על ייצור ROS בעזרת צבע, יש להבטיח ביטוי מספיק של diKillerRed-VKSKL או צביעת ליגנד SLP מסומן בצבע בתוך התאים המעניינים. בהתחשב בכך שסוגי תאים שונים או תאים בעלי רקע גנטי ...

פרוקסיזומים הם אברונים הקשורים לקרום יחיד הנמצאים ברוב התאים האיקריוטים. פרוקסיזומים הם תא מטבולי חיוני לביצוע חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד, קטבוליזם פורין, וסינתזה של פוספוליפידים וחומצות מרה באתר1. אצטיל-CoA המופק מפרוקסיזום שולט בהומאוסטזיס שומנים על ידי ויסות האיתות המרכזי בחילוף החומרים2. לכן, אין זה מפתיע כי תפקודים peroxisomal נפגע משתמע במחלות שונות, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות, הזדקנות, סרטן, השמנת יתר, סוכרת 3,4,5. תהליך חיוני בשמירה על פעולה peroxisomal הוא pexophagy. פקסופאגיה היא תהליך קטבולי לתחלופה סלקטיבית של פרוקסיזומים על ידי אוטופגיה. תאים משתמשים בפקסופאגיה כדי לסייע בשליטה על כמות ואיכות הפרוקסיזומים, ובכך להבטיח תפקוד פרוקסיזומלי תקין. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אובדן פרוקסיזום שנגרם על ידי מוטציות בגורמים הביולוגיים PEX1 peroxisomal 1 ו -6 נובע מפקסופאגיה בלתי מבוקרת6. יש לציין כי 65% מכלל החולים בהפרעת ביוגנזה פרוקסיזומית (PBD) סובלים מליקויים בקומפלקס פרוקסיזומלי AAA ATPase, המורכב מ-PEX1, PEX6 ו-PEX26 בתאי יונקים7.
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי ליזום וללמוד פקסופגיה. בשמרים, פקסופאגיה מופעלת כאשר חומרי המזון המסופקים עוברים ממקורות פחמן תלויי פרוקסיזום למקורות פחמן שאינם תלויים בפרוקסיזום (כדי להוריד את מספר הפרוקסיזום בתאים)8. לדוגמה, העברת תאי Pichia pastoris הגדלים מתנול ממדיום מתנול למדיום גלוקוז ומדיום אתנול משרה micropexophagy ו macropexophagy, בהתאמה 8,9,10. ממברנות מיקרופקסופאגיה קיבצו פרוקסיזומים לפירוק על ידי עיצוב מחדש של הוואקול ליצירת קרומי קיבוע ואקולריים דמויי גביע ומבנה דמוי מכסה המכונה מנגנון הממברנה הספציפי למיקרופקסופאגיה (MIPA). ב macropexophagy, peroxisomes בודדים נבלעים על ידי מבנים קרום כפול המכונה pexophagosomes, ואחריו איחוי עם vacuole עבור השפלה 8,9,10. הזרחן של קולטני פקסופגיה, כגון Atg36p ב- Saccharomyces cerevisiae ו- Atg30p ב- Pichia pastoris, הוא קריטי עבור הקולטנים לגייס מכונות אוטופגיה ליבה ולהקל על מיקוד פרוקסיזומלי לאוטופגוזומים 8,11.
בתאי יונקים, פקסופאגיה יכולה להיגרם על ידי יוביקוויטינציה. תיוג חלבוני הממברנה הפרוקסיזומלית PMP34 או PEX3 עם יוביקוויטין בצד הציטוסולי גורם לפקסופאגיה12. ביטוי היתר של PEX3 גורם לאוביקוויטינציה של פרוקסיזום וסילוק פרוקסיזום על ידי ליזוזומים13. בנוסף, המיזוג של PEX5 עם EGFP מסוף C פוגע בייצוא של PEX5 מונוביקוויטינציה וגורם לפקסופאגיה14. מצד שני, pexophagy יכול גם להיות מופעלות על ידי טיפול H 2 O2. פרוקסיזומים מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS); באופן ספציפי, האנזים הפרוקסיזומלי Acox1, אשר מזרז את השלב הראשוני של חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד (> 22 פחמן), מייצר לא רק אצטיל-CoA אלא גם ROS פרוקסיזומלי. בתגובה לרמות ROS מוגברות תחת טיפול H 2 O2, תאי יונקים מפעילים פקסופאגיה כדי להפחית את ייצור ה- ROS ולהקל על הלחץ. דווח כי טיפול H 2 O2מניע את הגיוס של אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM) peroxisomes. כספומט לאחר מכן phosphorylates PEX5 כדי לקדם מחזור peroxisomal על ידי pexophagy15.
מאחר שפרוקסיזומים הם מרכזים המייצרים ROS, הם גם מועדים לנזק ל-ROS. פציעות פרוקסיזומליות המעוררות ROS מאלצות תאים להפעיל פקסופאגיה כדי ליזום מסלולי בקרת איכות פרוקסיזום (הסרת הפרוקסיזום הפגום על ידי אוטופגיה). כאן, אנו מתארים גישה להפעלה לפי דרישה של פגיעה פרוקסיזומלית הנגרמת על ידי ROS. הפרוטוקול מנצל את ייצור ה-ROS המופעל באמצעות אור בתוך אברונים 16,17,18,19,20 (איור 1). פרוקסיזומים המסומנים בצבע מוארים ומובילים לייצור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, מה שגורם באופן ספציפי לפגיעה פרוקסיזומלית. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין. פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את בליעתם לתוך אוטופגוזומים להסרה פרטנית על ידי פקסופאגיה16. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את גורלם של פרוקסיזומים פצועים ובריאים באותו תא באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר. השיטה יכולה לשמש גם לפגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל התאים) על צלחת תרבית, מה שמאפשר ניתוח ביוכימי של מסלול הפקסופגיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

תאי יונקים יכולים להפוך פרוקסיזומים באמצעות פקסופאגיה בתיווך Stub1. המסלול מאפשר בקרה תאית על כמות ואיכות הפרוקסיזומים. במהלך תהליך זה, חלבון הלם חום 70 ויוביקוויטין E3 ליגאז, Stub1, עוברים לפרוקסיזומים כדי להפוך אותם כדי להתחיל פקסופגיה. פעילות ליגאז Stub1 מאפשרת הצטברות של יוביקוויטין ומודולים אחרים הקשורים לאוטופגיה על פרוקסיזומים ממוקדים. העלאת רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בלומן הפרוקסיזומלי יכולה להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1. ניתן, אם כן, להשתמש ביצירת ROS בסיוע צבע כדי להפעיל ולנטר מסלול זה. מאמר זה מתאר את ההליכים לשימוש בשני סוגים של צבעים, חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורופורים סינתטיים, כדי ליזום פקסופאגיה בתוך תרביות תאים של יונקים. פרוטוקולים מבוססי יצירת ROS בסיוע צבע אלה יכולים לשמש לא רק כדי להתמקד בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית תאים ברחבי העולם, אלא גם יכולים לאפשר מניפולציה של פרוקסיזומים בודדים בתוך תאים בודדים. אנו גם מתארים כיצד ניתן לעקוב אחר פקסופאגיה בתיווך Stub1 באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.

סכמת השראת הפקסופגיה בתיווך Stub1 המוצגת כאן מנצלת את היתרון של יצירת ROS בסיוע צבע בתוך לומן פרוקסיזום. פעולה זו דורשת עוצמות אור מינימליות. לכן, ניתן להאיר פרוקסיזומים המכילים חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים סטנדרטיים לסריקת לייזר. הארה מוקדית מובילה לייצור R...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

פרוטוקול זה מספק הוראות להפעלה ולניטור של פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתאים חיים.

ניטור Stub1-Mediated Pexophagy

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

פרוקסיזומים מבצעים חמצון בטא ומועדים לנזקי ROS. שיטה זו מאפשרת לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פרוקסיזומים בסטרס ROS. פרוטוקול זה משמש לא רק כדי להתמקד באופן גלובלי בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית התא, אלא יכול גם לאפשר מניפולציה של הפרוקסיזומים הבודדים בתוך תאים בודדים.ייצור ROS בסיוע צבע יכול לשמש גם כדי להתמקד באברונים מחוץ לפרוקסיזומים כדי לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פציעות אברונים. כדי להתחיל, זרעו פעמיים 10 לתאי SHSY5Y האנושיים החמישיים או שש פעמים 10 לעכבר הרביעי תאי NIH H3T3 ב 840 מיקרוליטר של מדיום תרבית על צלחות תרבית 35 מילימטר עם תחתית זכוכית מיקרווול בקוטר 20 מילימטר. לגדל את התאים תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.לאחר מכן, transfect את התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות מגיב transfection או SHSY5Y transfection התא. לדלל פלסמידים ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום ולדלל מיקרוליטר אחד של מגיב טרנספקציה ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום. שלב את ה- DNA המדולל עם מגיב מדולל.מערבבים בעדינות ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את הקומפלקס למיקרווול 20 מ"מ מצופה בעבר עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל תאי SHSY5Y ללא אנטיביוטיקה. נערו בעדינות את המנה קדימה ואחורה.בצע טרנספקציה של תאי NIH 3T3 כפי שהודגם קודם לכן, אך החלף את מדיום הסרום המוקטן במקום DMEM/F-12 ללא סרום לדילול פלסמיד ומגיב טרנספקציה. לאחר שעתיים של טרנספקציה, הסר את המדיום המכיל מגיב טרנספקציה והוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי. יש לדגור על תאי NIH 3T3 או SHSY5Y בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.לייצור ROS המופעל באמצעות אור, 24 שעות לאחר הטרנספקציה הסר את מדיום התרבית והוסף 10 מיקרוליטר של ליגנד HaloTag TMR 200 ננו-מולרי או 200 ננו-מולרי Janelia Fluor 646 HaloTag ligand על מיקרו-באר זכוכית 20 מילימטר. מעבירים את התבשיל לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ומשאירים אותו למשך שעה כדי להכתים את התאים. לאחר שעה, מסירים היטב את מצע הכתמים ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.מניחים צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את התאים הרצויים על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד באינקובטור על הבמה. בתוכנה, לחץ על חלון כלי, בחר Ocular, ולחץ על כפתור DIA כדי להפעיל את האור המועבר. צפו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ והביאו את התאים למיקוד על ידי סיבוב ידית המיקוד.בחר LSM ולחץ על גלאי הצבעים בחר כפתור. לחץ פעמיים על הצבעים הרצויים בחלון הקופץ כדי לבחור את הגדרות הלייזר והסינון המתאימות להדמיית התאים. לחץ על Live4x בחלונית Live כדי להתחיל סריקת לייזר מהירה כדי להתחיל לסנן את האותות הפלואורסצנטיים של התאים.הזז את הבמה באמצעות בקר הג'ויסטיק ואתר את התאים המבטאים diKillerRed VKSKL או SLP-VKSKL המדיום כדי להפעיל לחץ ROS על הפרוקסיזומים. לרכוש תמונה של התא הרצוי. לחץ על חלון הכלי ובחר גירוי LSM.לאחר מכן לחץ על כפתור האליפסה ובחלון Live Image השתמש בעכבר כדי לצייר החזר השקעה בקוטר של 15 מיקרומטר המכיל את הפרוקסיזומים הרצויים שעליהם יופעל לחץ ROS. כדי להחיל לחץ ROS, השתמש ב- 561 ננומטר עבור תאים עם ליגנד SLP שכותרתו diKillerRed VKSKL או TMR והשתמש ב- 640 ננומטר עבור תאים המוכתמים בליגנד SLP של Janelia Fluor 646. בחר את אורך גל הלייזר להחלת מתח ROS.הזן את אחוז הלייזר הרצוי ואת משך הזמן. לייצור ROS בפרוקסיזומים, לחץ על רכש ולאחר מכן על כפתור הגירוי כדי להתחיל את הסריקה עם 561 או 640 ננומטר של אור דרך החזר ההשקעה למשך 30 שניות כל אחד. גירוי זה מתאים לכ-5% הגדרות עוצמת לייזר עבור 561 ו-640 ננומטר.לאחר 30 שניות של תאורת לייזר, פרוקסיזומים בתוך החזר ההשקעה מאבדים את אותות diKillerRed VKSKL, TMR או Janelia Fluor 646. אובדן אות זה מאפשר להבחין בין הפרוקסיזומים המוארים והלא מוארים בתוך התא. כדי לנטר את התאים החיים של הפקסופאג'ים, עקבו אחר הטרנסלוקציה של Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 או LC3B המתויגים ב-EGFP על הפרוקסיזומים המוארים או בעלי הלחץ של ROS על ידי הדמיה בהילוך מהיר תוך שימוש במרווחים של 10 דקות בין פריימים.תאורה מוקדית מובילה לייצור ROS מיידי ומקומי בתוך פרוקסיזומים בודדים, כפי שצוין על ידי כתב הפלואורסצנט roGFP2-VKSKL. תמונת diKillerRed VKSKL צולמה לאחר שכל המדידות של roGFP2-VKSKL נעשו כדי לציין את מיקום הפרוקסיזומים הפגומים. הנתונים מראים גם כי פרוקסיזומים לא מוארים אינם מושפעים, מה שמצביע על דיוק המתודולוגיה.מתודולוגיה זו שימשה לניטור פקסופאגיה בתיווך Stub1. במהלך תהליך זה, Hsp70, Stub1, חלבונים יוביקוויטינציה, מתאמי אוטופגיה p62 ו- LC3B מופיעים לאחר מכן בפרוקסיזומים בסטרס ROS כדי להניע פקסופגיה. באמצעות אותה אסטרטגיה, ניתן היה לפגוע בו זמנית בכל הפרוקסיזומים על צלחת תרבית לצורך אפיון ביוכימי של פקסופאגיה בתיווך Stub1.לפני תאורת ה-LED, פלואורסצנטיות EGFP-ubiquitin הייתה הומוגנית בציטופלסמה ולא התמזגה עם הפרוקסיזומים. לאחר תשע שעות של תאורת LED, אותות EGFP-ubiquitin הצטברו על כל הפרוקסיזומים בתאים שגדלו בצלחת קונפוקלית. באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין.פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את הסרתם על ידי פקסופגיה.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

הדמיה תפקודית עם חיזוק, Eyetracking, ניטור פיזיולוגית

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

דיקור ניטור השפעות על המוח האנושי על ידי fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

Bioassays עבור ההתנגדות הדברה ניטור

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...