Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
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この作業は、台湾の国家科学技術評議会からのMOST 111-2311-B-001-019-MY3研究助成金によって部分的にサポートされました。

1. ペルオキシソーム内腔にジキラーレッドまたは自己標識タンパク質(SLP)を発現する細胞の調製
<ol><li>ガラス底の細胞培養皿に目的の細胞を播種します。ここでの実験では、840 μLの培養液(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F-12)または840 μLの培養液(10%ウシ血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)中の6 x 104マウスNIH3...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

このプロトコルは、光でペルオキシソームROSレベルを上昇させることにより、細胞培養内でStub1を介したペキソファジーをトリガーする方法を詳述しています。このプロトコルは色素支援ROS生成に依存しているため、目的の細胞内でdiKillerRed-VKSKLまたは色素標識SLPリガンド染色の十分な発現を確保する必要があります。異なる細胞型または異なる遺伝的背景の細胞がわずかに異なる特性を有す...

ペルオキシソームは、ほとんどの真核細胞に存在する単膜結合オルガネラです。ペルオキシソームは、超長鎖脂肪酸のベータ酸化、プリン異化作用、およびエーテルリン脂質と胆汁酸の合成を行うために不可欠な代謝コンパートメントです1。ペルオキシソーム由来アセチルCoAは、代謝における中枢シグナル伝達を制御することにより、脂質恒常性を制御します2。したがって、ペルオキシソーム機能の低下が、神経変性疾患、老化、癌、肥満、および糖尿病を含む様々な疾患において暗示されることは驚くべきことではない3、4、5。ペルオキシソーム操作の維持に不可欠なプロセスはペキソファジーです。ペキソファジーは、オートファジーによるペルオキシソームの選択的代謝回転のための異化プロセスです。細胞はペキソファジーを使用してペルオキシソームの量と質を制御し、それによって適切なペルオキシソーム機能を確保します。最近の研究では、PEX1ペルオキシソーム生合成因子1および6の突然変異によって引き起こされるペルオキシソーム喪失は、制御されていないペキソファジー6に起因することが実証されました。特に、すべてのペルオキシソーム生合成障害(PBD)患者の65%は、哺乳類細胞のPEX1、PEX6、およびPEX26で構成されるペルオキシソームAAA ATPase複合体に欠損を抱いています7。
ペキソファジーを開始および研究するために、いくつかの方法を使用できます。酵母では、供給された栄養素がペルオキシソーム依存性炭素源からペルオキシソーム非依存炭素源(細胞ペルオキシソーム数の低下)に切り替えられたときにペキソファジーがトリガーされます8。例えば、メタノール培地からグルコース培地およびエタノール培地へのメタノール増殖ピキア牧草細胞の転写は、それぞれミクロペキソファジーおよびマクロペキソファジーを誘導する8、9、10。マイクロペキソファジー隔離剤は、液胞をリモデリングしてカップ状の液胞隔離膜と、マイクロペキソファジー特異的膜装置(MIPA)と呼ばれる蓋状の構造を形成することにより、ペルオキシソームをクラスター化して分解します。マクロペキソファジーでは、個々のペルオキシソームはペキソファゴソームとして知られる二重膜構造に飲み込まれ、続いて液胞と融合して分解されます8,9,10。サッカロミセス・セレビシエのAtg36pやピキア・パストリスのAtg30pなどのペキソファジー受容体のリン酸化は、受容体がコアオートファジー機構を動員し、オートファゴソームへのペルオキシソーム標的化を促進するために重要です8,11。
哺乳類細胞では、ユビキチン化によってペキソファジーを誘導することができます。ペルオキシソーム膜タンパク質PMP34またはPEX3を細胞質側にユビキチンでタグ付けすると、ペキソファジー12が誘導されます。PEX3の過剰発現は、ペルオキシソームユビキチン化およびリソソームによるペルオキシソーム排除を誘導する13。さらに、PEX5とC末端EGFPとの融合は、モノユビキチン化PEX5の輸出を損ない、ペキソファジーをもたらす14。一方、ペキソファジーはH2O2処理によっても引き起こされる可能性があります。ペルオキシソームは活性酸素種(ROS)を産生する。具体的には、超長鎖脂肪酸(炭素数22>)のベータ酸化の初期段階を触媒するペルオキシソーム酵素Acox1は、アセチルCoAだけでなくペルオキシソームROSも生成します。H2O2処理下で上昇したROSレベルに応答して、哺乳動物細胞はペキソファジーを活性化してROS産生を低下させ、ストレスを緩和する。H 2 O2治療は、ペルオキシソームへの毛細血管拡張運動失調(ATM)変異の動員を促進することが報告されています。次に、ATMはPEX5をリン酸化して、ペキソファジー15によるペルオキシソーム代謝回転を促進します。
ペルオキシソームはROS発生中心であるため、ROS損傷を受けやすい。ROS誘発性ペルオキシソーム損傷は、細胞にペキソファジーを活性化させ、ペルオキシソーム品質管理経路(オートファジーによる損傷したペルオキシソームの除去)を開始します。ここでは、ROS誘発性ペルオキシソーム損傷のオンデマンドトリガーへのアプローチを概説します。このプロトコルは、細胞小器官16、17、18、19、20内での光活性化ROS産生を利用します(図1)。色素標識されたペルオキシソームが照射され、ペルオキシソーム内腔内でROS産生が起こり、ペルオキシソーム損傷を特異的に引き起こします。このプロトコルを使用して、ROSストレスペルオキシソームがユビキチン依存性分解経路を介して除去されることが示されている。ROSストレスペルオキシソームは、ユビキチンE3リガーゼStub1をリクルートして、ペキソファジー16による個々の除去のためにオートファゴソームに飲み込むことを可能にします。このプロトコルを使用して、タイムラプス顕微鏡によって同じ細胞内の損傷したペルオキシソームと健康なペルオキシソームの運命を比較することができます。この方法は、培養皿上のすべてのペルオキシソーム(すべての細胞内)を全体的に損傷するためにも使用でき、ペキソファジー経路の生化学的分析を可能にします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

哺乳類細胞は、Stub1を介したペキソファジーを介してペルオキシソームをターンオーバーすることができます。この経路は、ペルオキシソームの量と質の細胞制御を可能にする可能性があります。このプロセスの間に、ヒートショックタンパク質70とユビキチンE3リガーゼStub1がペルオキシソーム上に移動し、ペキソファジーを開始するためにひっくり返されます。Stub1リガーゼ活性により、標的ペルオキシソーム上にユビキチンやその他のオートファジー関連モジュールを蓄積することができます。ペルオキシソーム内腔内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させると、Stub1を介したペキソファジーが活性化される可能性があります。したがって、色素支援ROS生成を使用して、この経路をトリガーおよび監視することができます。本稿では、蛍光タンパク質と合成蛍光色素の2つのクラスの色素を使用して、哺乳類細胞培養内でペキソファジーを開始する手順について概説します。これらの色素支援ROS生成ベースのプロトコルは、世界中の細胞集団内のすべてのペルオキシソームを標的とするために使用できるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。また、生細胞顕微鏡を使用してStub1を介したペキソファジーを追跡する方法についても説明します。

ここに示すStub1を介したペキソファジー誘導スキームは、ペルオキシソーム内腔内での色素支援ROS生成を利用します。この操作には、最小限の光強度が必要です。したがって、蛍光タンパク質または色素を含むペルオキシソームは、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して照明することができます。焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシ?...

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Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

このプロトコルは、生細胞におけるStub1を介したペキソファジーをトリガーおよびモニタリングするための指示を提供します。

スタブ1を介したペキソファジーのモニタリング

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

ペルオキシソームはベータ酸化を行い、ROS損傷を受けやすい。この方法は、細胞がROSストレスペルオキシソームをどのように扱うかを調べることを可能にする。このプロトコルは、細胞集団内のすべてのペルオキシソームをグローバルに標的化するために使用されるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。色素支援ROS生成は、ペルオキシソーム以外の細胞小器官を標的にして、細胞が細胞小器官損傷にどのように対処するかを調べるためにも使用できます。まず、直径20ミリメートルのガラスマイクロウェルを備えたガラス底の35ミリメートル培養皿に、840マイクロリットルの培養液に10から5番目のヒトSHSY5Y細胞を2倍、または4番目のマウスNIH H3T3細胞に10の6倍を播種します。5%下で細胞を摂氏37度で24時間増殖させます。次に、トランスフェクション試薬またはSHSY5Y細胞トランスフェクションを用いて、細胞を目的のプラスミドでトランスフェクションします。プラスミドを55マイクロリットルの無血清DMEM/F-12で希釈し、1マイクロリットルのトランスフェクション試薬を55マイクロリットルの無血清DMEM/F-12で希釈します。希釈したDNAを希釈試薬と組み合わせます。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。抗生物質を含まないSHSY5Y細胞を含む100マイクロリットルの培養液で予め播種した20ミリメートルのマイクロウェルに複合体を追加します。皿を前後にそっと振る。前述のようにNIH 3T3細胞トランスフェクションを実行しますが、プラスミド希釈およびトランスフェクション試薬には、無血清DMEM/F-12の代わりに還元血清培地を使用してください。2時間のトランスフェクション後、トランスフェクション試薬含有培地を取り出し、1ミリリットルの新しい培養培地を加えます。NIH 3T3またはSHSY5Y細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。光活性化ROS産生の場合、トランスフェクション後24時間で培地を除去し、10マイクロリットルの200ナノモルHaloTag TMRリガンドまたは200ナノモルのJanelia Fluor 646 HaloTagリガンドを20ミリメートルのガラスマイクロウェルに加えます。皿を摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに移し、細胞を染色するために1時間放置します。1時間後、染色培地を完全に除去し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を加えます。目的の細胞を含むガラス底皿を、ステージトップインキュベーターを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡上に置きます。ソフトウェアで、[ツールウィンドウ]をクリックし、[接眼レンズ]を選択し、[DIA]ボタンをクリックして透過光をオンにします。顕微鏡の接眼レンズを通して皿を見て、フォーカスノブを回して細胞に焦点を合わせます。LSMを選択し、色素検出器選択ボタンをクリックします。ポップアップウィンドウで目的の色素をダブルクリックして、細胞をイメージングするための適切なレーザーとフィルターの設定を選択します。ライブパネルのLive4xをクリックして高速レーザースキャンを開始し、細胞の蛍光シグナルのスクリーニングを開始します。ジョイスティックコントローラーを使用してステージを移動し、培地のdiKillerRed VKSKLまたはSLP-VKSKL発現細胞を見つけて、ペルオキシソームにROSストレスを適用します。目的のセルの画像を取得します。ツールウィンドウをクリックし、LSM刺激を選択します。次に、楕円ボタンをクリックし、ライブ画像ウィンドウでマウスを使用して、ROSストレスが適用される目的のペルオキシソームを含む直径15マイクロメートルのROIを描画します。ROSストレスを適用するには、diKillerRed VKSKLまたはTMR標識SLPリガンドを有する細胞には561ナノメートルを使用し、Janelia Fluor 646標識SLPリガンドで染色された細胞には640ナノメートルを使用します。ROSストレスを適用するレーザー波長を選択します。希望のレーザーのパーセンテージと持続時間を入力します。ペルオキシソームでのROS産生については、[取得]、[刺激]ボタンの順にクリックして、ROIを介して561ナノメートルまたは640ナノメートルの光でそれぞれ30秒間スキャンを開始します。この刺激は、561ナノメートルと640ナノメートルの約5%レーザー出力設定に相当します。レーザー照射の30秒後、ROI内のペルオキシソームは、ジキラーレッドVKSKL、TMR、またはジャネリアフルーア646シグナルを失います。このシグナル損失により、細胞内の照らされたペルオキシソームと照らされていないペルオキシソームを区別することができます。ペキソファージ生細胞をモニタリングするには、EGFPタグ付きStub1、Hsp70、ユビキチン、p62、またはLC3Bの、照明付きペルオキシソームまたはROSストレスペルオキシソームへの転座を、フレーム間に10分間隔でタイムラプスイメージングして追跡します。焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシソーム内で瞬間的かつ局所的なROS産生をもたらす。diKillerRed VKSKL画像は、損傷したペルオキシソームの位置を示すためにすべてのroGFP2-VKSKL測定が行われた後に撮影されました。データはまた、照射されていないペルオキシソームが影響を受けないことを示しており、方法論の精度を示しています。この方法論は、Stub1を介したペキソファジーを監視するために使用されました。このプロセスの間、Hsp70、Stub1、ユビキチン化タンパク質、オートファジーアダプターp62およびLC3Bが続いてROSストレスペルオキシソームに現れ、ペキソファジーを駆動します。同じ戦略を使用して、Stub1を介したペキソファジーの生化学的特性評価のために、培養皿上のすべてのペルオキシソームを同時に損傷させることができました。LED照明前は、EGFP-ユビキチン蛍光は細胞質内で均一であり、ペルオキシソームと共局在しませんでした。9時間のLED照明の後、EGFP-ユビキチンシグナルは、共焦点皿で増殖した細胞内のすべてのペルオキシソームに蓄積しました。このプロトコルを使用して、ROSストレスペルオキシソームがユビキチン依存性の分解経路を介して除去されることを発見しました。ROSストレスペルオキシソームは、ユビキチンE3リガーゼStub1をリクルートして、ペキソファジーによる除去を可能にします。

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

生物学

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

強化、Eyetracking、および生体モニタリングによる機能イメージング

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

fMRIによるヒト脳機能に対する鍼の効果のモニタリング

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

モニタリングの殺虫剤抵抗性のためのバイオアッセイ

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...