Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
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Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa MOST 111-2311-B-001-019-MY3 do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan.

1. Preparação de células expressando diKillerRed ou proteínas auto-marcadas (SLPs) no lúmen do peroxissomo
<ol><li>Seme as células desejadas em placas de cultura celular com fundo de vidro. Para o experimento, foram utilizadas 2 x10 5 células SHSY5Y humanas em 840 μL de meio de cultura (DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina) ou 6 x 104 células NIH3T3 de camundongo em 840 μL de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de s...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Este protocolo detalha como desencadear a pexofagia mediada por Stub1 em culturas de células elevando os níveis de ROS peroxissomais com luz. Como o protocolo depende da geração de ROS assistida por corante, é necessário garantir a expressão suficiente de diKillerRed-VKSKL ou coloração de ligante SLP marcada com corante dentro das células de interesse. Dado que diferentes tipos celulares ou células de diferentes origens genéticas podem abrigar peroxissomas com propriedades ligeiramente diferentes, pode-se pre...

Os peroxissomas são organelas ligadas a uma única membrana presentes na maioria das células eucarióticas. Os peroxissomas são um compartimento metabólico essencial para a realização da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, catabolismo de purinas e síntese de fosfolipídios éteres e ácidos biliares1. O acetil-CoA derivado do peroxissomo controla a homeostase lipídica regulando a sinalização central no metabolismo2. Portanto, não é surpresa que o comprometimento das funções peroxissomais esteja implicado em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, envelhecimento, cânceres, obesidade e diabetes 3,4,5. Um processo essencial na manutenção da operação peroxissomal é a pexofagia. A puxofagia é um processo catabólico para o turnover seletivo de peroxissomas por autofagia. As células usam a pexofagia para ajudar a controlar a quantidade e a qualidade dos peroxissomos, garantindo assim a função peroxissomal adequada. Um estudo recente demonstrou que a perda de peroxissomo causada por mutações nos fatores 1 e 6 da biogênese peroxissomal PEX1 resulta de pexofagia não controlada6. Notavelmente, 65% de todos os pacientes com transtorno da biogênese do peroxissomo (DBP) apresentam deficiências no complexo ATPase AAA peroxissomal, composto por PEX1, PEX6 e PEX26em células de mamíferos7.
Vários métodos podem ser usados para iniciar e estudar a pexofagia. Em leveduras, a pexofagia é desencadeada quando os nutrientes fornecidos são trocados de fontes de carbono dependentes de peroxissomo para fontes de carbono independentes de peroxissomo (para diminuir o número de peroxissomas celulares)8. Por exemplo, a transferência de células de Pichia pastoris cultivadas com metanol do meio metanol para o meio glicosado e etanol induz micropexofagia e macropexofagia, respectivamente 8,9,10. A micropexofagia sequestra peroxissomas agrupados para degradação, remodelando o vacúolo para formar membranas de sequestro vacuolar em forma de taça e uma estrutura semelhante a uma tampa denominada aparato de membrana específico para micropexofagia (MIPA). Na macropexofagia, os peroxissomas individuais são engolidos por estruturas de membrana dupla conhecidas como pexofagossomos, seguidos de fusão com o vacúolo para degradação 8,9,10. A fosforilação de receptores de pexofagia, como Atg36p em Saccharomyces cerevisiae e Atg30p em Pichia pastoris, é crítica para recrutar maquinaria de autofagia central e facilitar o direcionamento peroxissomal para autofagossomos 8,11.
Em células de mamíferos, a pexofagia pode ser induzida por ubiquitinação. A marcação das proteínas da membrana peroxissomal PMP34 ou PEX3 com ubiquitina no lado citosólico induz a pexofagia12. A superexpressão de PEX3 induz a ubiquitinação do peroxissomo e a eliminação do peroxissomo pelos lisossomos13. Além disso, a fusão de PEX5 com um EGFP C-terminal prejudica a exportação de PEX5 monoubiquitinado e resulta em pexofagia14. Por outro lado, a pexofagia também pode ser desencadeada pelo tratamento com H 2 O2. Os peroxissomas produzem espécies reativas de oxigênio (EROs); especificamente, a enzima peroxissomal Acox1, que catalisa a etapa inicial da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa (carbono > 22), produz não apenas acetil-CoA, mas também ROS peroxissomal. Em resposta aos níveis elevados de ROS sob o tratamento comH 2 O2, as células de mamíferos ativam a pexofagia para diminuir a produção de ROS e aliviar o estresse. Tem sido relatado que o tratamento com H 2 O2direciona o recrutamento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) para peroxissomas. A ATM fosforila então PEX5 para promover o turnover peroxissomal pela pexofagia15.
Como os peroxissomas são centros geradores de ROS, eles também são propensos a danos de ROS. Lesões peroxissomais provocadas por ERO forçam as células a ativar a pexofagia para iniciar vias de controle de qualidade do peroxissomo (remoção do peroxissomo danificado por autofagia). Aqui, delineamos uma abordagem para o desencadeamento sob demanda de lesão peroxissomal provocada por ROS. O protocolo aproveita a produção de ERO ativadas por luz dentro de organelas 16,17,18,19,20 (Figura 1). Os peroxissomas marcados com corante são iluminados, levando à produção de ERO dentro da luz peroxissomal, o que desencadeia especificamente a lesão peroxissomal. Usando este protocolo, mostra-se que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina. Os peroxissomas estressados com ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir seu engolfamento em autofagossomos para remoção individual por pexofagia16. Pode-se usar este protocolo para comparar o destino de peroxissomas lesionados e saudáveis dentro de uma mesma célula por microscopia de lapso de tempo. O método também pode ser usado para danificar globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em uma placa de cultura, permitindo a análise bioquímica da via da pexofagia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Células de mamíferos podem transformar peroxissomas através da pexofagia mediada por Stub1. A via potencialmente permite o controle celular da quantidade e qualidade dos peroxissomos. Durante esse processo, a proteína de choque térmico 70 e a ubiquitina E3 ligase, Stub1, translocam-se em peroxissomas para serem viradas para iniciar a pexofagia. A atividade da ligase Stub1 permite o acúmulo de ubiquitina e outros módulos relacionados à autofagia em peroxissomas alvo. A elevação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da luz peroxissomal pode ativar a pexofagia mediada por Stub1. Pode-se, portanto, usar a geração de ROS assistida por corante para desencadear e monitorar essa via. Este artigo descreve os procedimentos para o uso de duas classes de corantes, proteínas fluorescentes e fluoróforos sintéticos, para iniciar a pexofagia em culturas de células de mamíferos. Esses protocolos baseados na geração de ROS assistida por corante podem não apenas ser usados para atingir todos os peroxissomas dentro de uma população celular globalmente, mas também podem permitir a manipulação de peroxissomas individuais dentro de células únicas. Também descrevemos como a pexofagia mediada por Stub1 pode ser acompanhada usando microscopia de células vivas.

O esquema de indução de pelofagia mediado por Stub1 mostrado aqui aproveita a geração de ROS assistida por corante dentro do lúmen do peroxissomo. Esta operação requer intensidades luminosas mínimas. Peroxissomas contendo proteínas fluorescentes ou corantes podem, portanto, ser iluminados usando microscópios confocais de varredura a laser padrão. A iluminação focal leva à produção instantânea e localizada de ERO dentro de peroxissomas individuais, como indicado pelo repórter fluorescente roGFP2-VKSKL (<...

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Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Este protocolo fornece instruções para o desencadeamento e monitoramento da pexefagia mediada por Stub1 em células vivas.

Monitoramento da Coxofagia Mediada por Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Os peroxissomas realizam a beta oxidação e são propensos a danos de ROS. Este método permite investigar como as células lidam com peroxissomas estressados por ROS. Este protocolo não é usado apenas para atingir globalmente todos os peroxissomas dentro de uma população celular, mas também pode permitir a manipulação dos peroxissomas individuais dentro de células únicas.A geração de ROS assistida por corante também pode ser usada para atingir organelas fora dos peroxissomas para investigar como as células lidam com lesões de organelas. Para começar, semeie duas vezes 10 para a quinta célula SHSY5Y humana ou seis vezes 10 para a quarta célula NIH H3T3 de camundongo em 840 microlitros de meio de cultura em placas de cultura de 35 milímetros com fundo de vidro com um micropoço de vidro de 20 milímetros de diâmetro. Cultivar as células sob 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas.Em seguida, transfectar as células com plasmídeos desejados usando um reagente de transfecção ou transfecção de células SHSY5Y. Diluir plasmídeos em 55 microlitros de DMEM/F-12 sem soro e diluir um microlitro de reagente de transfecção em 55 microlitros de DMEM/F-12 sem soro. Combinar o ADN diluído com o reagente diluído.Misture delicadamente e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Adicione o complexo ao micropoço de 20 milímetros previamente banhado com 100 microlitros de meio de cultura contendo células SHSY5Y sem antibióticos. Agite suavemente o prato para frente e para trás.Realizar a transfecção de células NIH 3T3 como demonstrado antes, mas substituir o meio de soro reduzido em vez de DMEM/F-12 livre de soro para diluição de plasmídios e reagente de transfecção. Após duas horas da transfecção, remova o meio contendo reagente de transfecção e adicione um mililitro de meio de cultura fresco. Incubar as células NIH 3T3 ou SHSY5Y a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Para a produção de ROS ativadas por luz, em 24 horas após a transfecção remova o meio de cultura e adicione 10 microlitros de 200 nanomolares HaloTag TMR ligante ou 200 nanomolares Janelia Fluor 646 HaloTag ligante no micropoço de vidro de 20 milímetros. Transfira o prato para uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e deixe por uma hora para manchar as células. Após uma hora, remova bem o meio de coloração e adicione um mililitro de meio de cultura fresco.Coloque um prato com fundo de vidro contendo as células desejadas em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma incubadora de palco. No software, clique em Janela de ferramentas, escolha Ocular e clique no botão DIA para acender a luz transmitida. Visualize o prato através da ocular do microscópio e coloque as células em foco girando o botão de foco.Escolha LSM e clique no botão Dye Detector Select. Clique duas vezes nos corantes desejados na janela pop-up para selecionar as configurações apropriadas de laser e filtro para gerar imagens das células. Clique em Live4x no painel Live para iniciar a varredura rápida a laser para iniciar a triagem dos sinais fluorescentes das células.Mova o palco usando o controlador de joystick e localize as células médias que expressam diKillerRed VKSKL ou SLP-VKSKL para aplicar estresse ROS nos peroxissomos. Adquira uma imagem da célula desejada. Clique em Janela de ferramentas e escolha Estimulação LSM.Em seguida, clique no botão de elipse e, na janela Live Image, use o mouse para desenhar uma ROI de 15 micrômetros de diâmetro contendo os peroxissomas desejados aos quais a tensão ROS será aplicada. Para aplicar o estresse ROS, use 561 nanômetros para células com o ligante SLP marcado com diKillerRed VKSKL ou TMR e use 640 nanômetros para células coradas com o ligante SLP marcado com Janelia Fluor 646. Selecione o comprimento de onda do laser para aplicar a tensão ROS.Insira a porcentagem de laser desejada e a duração. Para a produção de ROS nos peroxissomos, clique em Adquirir e, em seguida, no botão Estimulação para iniciar a varredura com 561 ou 640 nanômetros de luz através das ROIs por 30 segundos cada. Essa estimulação corresponde a aproximadamente 5% de potência do laser para 561 e 640 nanômetros.Após 30 segundos de iluminação a laser, os peroxissomas dentro das ROIs perdem seus sinais diKillerRed VKSKL, TMR ou Janelia Fluor 646. Esta perda de sinal permite distinguir os peroxissomas iluminados e não iluminados dentro da célula. Para monitorar as células vivas de pexófagos, siga a translocação de Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 ou LC3B marcados com EGFP para os peroxissomas iluminados ou estressados por ROS, por meio de imagens de lapso de tempo usando intervalos de 10 minutos entre os quadros.A iluminação focal leva à produção instantânea e localizada de ROS dentro de peroxissomas individuais, como indicado pelo repórter fluorescente roGFP2-VKSKL. A imagem diKillerRed VKSKL foi obtida após todas as medidas de roGFP2-VKSKL terem sido feitas para indicar a localização dos peroxissomas danificados. Os dados também mostram que os peroxissomas não iluminados não são afetados, indicando a precisão da metodologia.Esta metodologia foi utilizada para monitorar a pexofagia mediada por Stub1. Durante esse processo, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptadores de autofagia p62 e LC3B aparecem subsequentemente em peroxissomas estressados por ROS para conduzir a pexofagia. Usando a mesma estratégia, foi possível danificar simultaneamente todos os peroxissomas em uma placa de cultura para a caracterização bioquímica da pexofagia mediada por Stub1.Antes da iluminação por LED, a fluorescência EGFP-ubiquitina era homogênea no citoplasma e não colocalizava com os peroxissomos. Após nove horas de iluminação LED, os sinais de EGFP-ubiquitina se acumularam em todos os peroxissomas nas células cultivadas em uma placa confocal. Usando este protocolo, descobrimos que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina.Os peroxissomas estressados por ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir sua remoção por pexofagia.

Research

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