Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán.

1. Preparación de células que expresan diKillerRed o proteínas automarcantes (SLP) en la luz del peroxisoma
<ol><li>Siembra las células deseadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. Para el experimento aquí, sembrar 2 x 105 células SHSY5Y humanas en 840 μL de medio de cultivo (DMEM / F-12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) o 6 x 10 4 células NIH3T3de ratón en 840 μL de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% d...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente ...

Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliareséter 1. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo2. Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, envejecimiento, cáncer, obesidad y diabetes 3,4,5. Un proceso esencial en el mantenimiento de la operación peroxisomal es la pexofagia. La pexofagia es un proceso catabólico para el recambio selectivo de peroxisomas por autofagia. Las células utilizan la pexofagia para ayudar a controlar la cantidad y calidad de los peroxisomas, asegurando así una función peroxisomal adecuada. Un estudio reciente demostró que la pérdida de peroxisomas causada por mutaciones en los factores de biogénesis peroxisomal PEX1 1 y 6 resulta de la pexofagia no controlada6. En particular, el 65% de todos los pacientes con trastorno de biogénesis de peroxisomas (PBD) albergan deficiencias en el complejo ATPasa AAA peroxisomal, compuesto por PEX1, PEX6 y PEX26 en células de mamíferos7.
Se pueden utilizar varios métodos para iniciar y estudiar la pexofagia. En la levadura, la pexofagia se desencadena cuando los nutrientes suministrados se cambian de fuentes de carbono dependientes del peroxisoma a fuentes de carbono independientes del peroxisoma (para reducir el número de peroxisomas celulares)8. Por ejemplo, la transferencia de células de Pichia pastoris cultivadas con metanol del medio metanol al medio de glucosa y al medio de etanol induce micropexofagia y macropexofagia, respectivamente 8,9,10. Los secuestros de micropexofagia agrupan los peroxisomas para su degradación mediante la remodelación de la vacuola para formar membranas de secuestro vacuolar en forma de copa y una estructura similar a una tapa denominada aparato de membrana específico de micropexofagia (MIPA). En la macropexofagia, los peroxisomas individuales son engullidos por estructuras de doble membrana conocidas como pexofagosomas, seguidas de fusión con la vacuola para la degradación 8,9,10. La fosforilación de receptores de pexofagia, como Atg36p en Saccharomyces cerevisiae y Atg30p en Pichia pastoris, es crítica para que los receptores recluten maquinaria central de autofagia y faciliten la orientación peroxisomal a los autofagosomas 8,11.
En las células de mamíferos, la pexofagia puede ser inducida por ubiquitinación. El marcado de las proteínas de membrana peroxisomal PMP34 o PEX3 con ubiquitina en el lado citosólico induce pexofagia12. La sobreexpresión de PEX3 induce la ubiquitinación de los peroxisomas y la eliminación de los peroxisomas por los lisosomas13. Además, la fusión de PEX5 con un EGFP C-terminal perjudica la exportación de PEX5 monoubiquitinado y da lugar a pexofagia14. Por otro lado, la pexofagia también puede ser desencadenada por el tratamiento conH2O2. Los peroxisomas producen especies reactivas de oxígeno (ROS); específicamente, la enzima peroxisomal Acox1, que cataliza el paso inicial de la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (> 22 carbono), produce no solo acetil-CoA sino también ROS peroxisomal. En respuesta a los niveles elevados de ROS bajo el tratamiento conH2O2, las células de mamíferos activan la pexofagia para reducir la producción de ROS y aliviar el estrés. Se ha informado que el tratamiento conH2O2impulsa el reclutamiento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) a peroxisomas. ATM luego fosforila PEX5 para promover el recambio peroxisomal por pexofagia15.
Dado que los peroxisomas son centros generadores de ROS, también son propensos al daño de ROS. Las lesiones peroxisomales provocadas por ROS obligan a las células a activar la pexofagia para iniciar las vías de control de calidad del peroxisoma (eliminación del peroxisoma dañado por autofagia). Aquí, describimos un enfoque para el desencadenamiento a demanda de la lesión peroxisomal provocada por ROS. El protocolo aprovecha la producción de ROS activadas por luz dentro de los orgánulos 16,17,18,19,20 (Figura 1). Los peroxisomas marcados con colorante se iluminan, lo que lleva a la producción de ROS dentro de la luz peroxisomal, lo que desencadena específicamente la lesión peroxisomal. Usando este protocolo, se muestra que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina. Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su inmersión en autofagosomas para su eliminación individual por pexofagia16. Se puede usar este protocolo para comparar el destino de los peroxisomas lesionados y sanos dentro de la misma célula mediante microscopía de lapso de tiempo. El método también se puede utilizar para dañar globalmente todos los peroxisomas (en todas las células) en una placa de cultivo, lo que permite el análisis bioquímico de la vía de pexofagia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.

El esquema de inducción de pexofagia mediado por Stub1 que se muestra aquí aprovecha la generación de ROS asistida por colorante dentro de la luz del peroxisoma. Esta operación requiere intensidades de luz mínimas. Por lo tanto, los peroxisomas que contienen proteínas o colorantes fluorescentes pueden iluminarse utilizando microscopios confocales estándar de barrido láser. La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el repo...

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Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.

Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Los peroxisomas llevan a cabo la oxidación beta y son propensos al daño de ROS. Este método permite investigar cómo las células lidian con los peroxisomas estresados por ROS. Este protocolo no solo se utiliza para atacar globalmente todos los peroxisomas dentro de una población celular, sino que también puede permitir la manipulación de los peroxisomas individuales dentro de células individuales.La generación de ROS asistida por colorante también se puede usar para atacar orgánulos fuera de los peroxisomas para investigar cómo las células lidian con las lesiones de orgánulos. Para comenzar, siembre dos veces 10 a la quinta células SHSY5Y humanas o seis veces 10 a la cuarta células NIH H3T3 de ratón en 840 microlitros de medio de cultivo en placas de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio con un micropocillo de vidrio de 20 milímetros de diámetro. Cultive las células por debajo del 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 24 horas.A continuación, transfecte las células con los plásmidos deseados utilizando un reactivo de transfección o transfección de células SHSY5Y. Diluir plásmidos en 55 microlitros de DMEM/F-12 sin suero y diluir un microlitro de reactivo de transfección en 55 microlitros de DMEM/F-12 sin suero. Combine el ADN diluido con el reactivo diluido.Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agregue el complejo al micropocillo de 20 milímetros previamente chapado con 100 microlitros de medio de cultivo que contiene células SHSY5Y sin antibióticos. Agite suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás.Realice la transfección de células NIH 3T3 como se demostró antes, pero sustituya el medio sérico reducido en lugar de DMEM / F-12 sin suero por dilución de plásmidos y reactivo de transfección. Después de dos horas de transfección, retire el medio que contiene reactivo de transfección y agregue un mililitro de medio de cultivo fresco. Incubar las células NIH 3T3 o SHSY5Y a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.Para la producción de ROS activadas por luz, a las 24 horas posteriores a la transfección, retire el medio de cultivo y agregue 10 microlitros de 200 nanomolares del ligando HaloTag TMR o 200 nanomolares Janelia Fluor 646 HaloTag en el micropocillo de vidrio de 20 milímetros. Transfiera el plato a una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y déjelo durante una hora para teñir las células. Después de una hora, retire bien el medio de tinción y agregue un mililitro de medio de cultivo fresco.Coloque un plato con fondo de vidrio que contenga las células deseadas en un microscopio confocal de escaneo láser equipado con una incubadora de etapa. En el software, haga clic en Ventana de herramientas, elija Ocular y haga clic en el botón DIA para encender la luz transmitida. Vea el plato a través del ocular del microscopio y enfoque las células girando la perilla de enfoque.Elija LSM y haga clic en el botón Seleccionar detector de tinte. Haga doble clic en los tintes deseados en la ventana emergente para seleccionar la configuración adecuada de láser y filtro para obtener imágenes de las células. Haga clic en Live4x en el panel Live para iniciar un escaneo láser rápido para comenzar a detectar las señales fluorescentes de las células.Mueva el escenario con el controlador del joystick y localice las células diKillerRed VKSKL o SLP-VKSKL medianas para aplicar tensión ROS en los peroxisomas. Adquirir una imagen de la célula deseada. Haga clic en Ventana de herramientas y elija LSM Stimulation.Luego haga clic en el botón de elipse y en la ventana Live Image use el mouse para dibujar un ROI de 15 micrómetros de diámetro que contenga los peroxisomas deseados a los que se aplicará la tensión ROS. Para aplicar estrés ROS, use 561 nanómetros para células con el ligando SLP marcado con diKillerRed VKSKL o TMR y use 640 nanómetros para células teñidas con el ligando SLP marcado con Janelia Fluor 646. Seleccione la longitud de onda del láser para aplicar la tensión ROS.Introduzca el porcentaje de láser deseado y la duración. Para la producción de ROS en los peroxisomas, haga clic en Adquirir y luego en el botón Estimulación para iniciar el escaneo con 561 o 640 nanómetros de luz a través de los ROI durante 30 segundos cada uno. Esta estimulación corresponde a aproximadamente 5% de ajustes de potencia láser para 561 y 640 nanómetros.Después de 30 segundos de iluminación láser, los peroxisomas dentro de los ROI pierden sus señales diKillerRed VKSKL, TMR o Janelia Fluor 646. Esta pérdida de señal permite distinguir los peroxisomas iluminados y no iluminados dentro de la célula. Para monitorear las células vivas pexófagas, siga la translocación de Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 o LC3B marcados con EGFP en los peroxisomas iluminados o estresados por ROS mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando intervalos de 10 minutos entre cuadros.La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el reportero fluorescente roGFP2-VKSKL. La imagen de diKillerRed VKSKL se tomó después de que se realizaron todas las mediciones de roGFP2-VKSKL para indicar la ubicación de los peroxisomas dañados. Los datos también muestran que los peroxisomas no iluminados no se ven afectados, lo que indica la precisión de la metodología.Esta metodología se utilizó para monitorizar la pexofagia mediada por Stub1. Durante este proceso, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptadores de autofagia p62 y LC3B aparecen posteriormente en peroxisomas estresados por ROS para impulsar la pexofagia. Usando la misma estrategia, fue posible dañar simultáneamente todos los peroxisomas en una placa de cultivo para la caracterización bioquímica de la pexofagia mediada por Stub1.Antes de la iluminación LED, la fluorescencia de EGFP-ubiquitina era homogénea en el citoplasma y no colocalizaba con los peroxisomas. Después de nueve horas de iluminación LED, las señales de EGFP-ubiquitina se acumularon en todos los peroxisomas en las células cultivadas en una placa confocal. Usando este protocolo, encontramos que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina.Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su eliminación por pexofagia.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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