Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av ett MOST 111-2311-B-001-019-MY3 forskningsbidrag från National Science and Technology Council i Taiwan.

1. Beredning av celler som uttrycker diKillerRed eller självmärkande proteiner (SLP) i peroxisomlumen
<ol><li>Frö de önskade cellerna på glasbottnade cellodlingsrätter. För experimentet här, frö 2 x 105 humana SHSY5Y-celler i 840 μL odlingsmedium (DMEM / F-12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) eller 6 x 104 mus NIH3T3-celler i 840 μL odlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) på en 35 ...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Detta protokoll beskriver hur man utlöser Stub1-medierad pexofagi inom cellkulturer genom att höja peroxisomala ROS-nivåer med ljus. Eftersom protokollet bygger på färgassisterad ROS-generering måste man säkerställa tillräckligt uttryck av diKillerRed-VKSKL eller färgämnesmärkt SLP-ligandfärgning i cellerna av intresse. Med tanke på att olika celltyper eller celler med olika genetisk bakgrund kan hysa peroxisomer med något olika egenskaper, kan man behöva ställa in de exakta belysningsförhållandena fö...

Peroxisomer är enkelmembranbundna organeller som finns i de flesta eukaryota celler. Peroxisomer är ett metaboliskt fack som är nödvändigt för att utföra beta-oxidation av mycket långkedjiga fettsyror, purinkatabolism och eterfosfolipid- och gallsyrasyntes1. Peroxisom-härledd acetyl-CoA kontrollerar lipidhomeostas genom att reglera den centrala signaleringen i metabolism2. Därför är det ingen överraskning att komprometterade peroxisomala funktioner är underförstådda i olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa störningar, åldrande, cancer, fetma och diabetes 3,4,5. En viktig process vid upprätthållandet av peroxisomal drift är pexofagi. Pexophagy är en katabol process för selektiv omsättning av peroxisomer genom autofagi. Celler använder pexophagy för att hjälpa till att kontrollera kvantiteten och kvaliteten på peroxisomer, vilket säkerställer korrekt peroxisomal funktion. En nyligen genomförd studie visade att peroxisomförlust orsakad av mutationer i PEX1 peroxisomal biogenes faktor 1 och 6 är resultatet av okontrollerad pexofagi6. I synnerhet har 65% av alla patienter med peroxisombiogenessjukdom (PBD) brister i det peroxisomala AAA ATPas-komplexet, bestående av PEX1, PEX6 och PEX26 i däggdjursceller7.
Ett antal metoder kan användas för att initiera och studera pexofagi. I jäst utlöses pexophagy när de tillförda näringsämnena byts från peroxisomberoende kolkällor till peroxisomoberoende kolkällor (för att sänka cellulära peroxisomantal)8. Exempelvis inducerar överföringen av metanolodlade Pichia pastoris-celler från metanolmedium till glukosmedium och etanolmedium mikropexofagi respektive makropexofagi 8,9,10. Micropexophagy sekvestrerar grupperade peroxisomer för nedbrytning genom att omforma vakuolen för att bilda koppliknande vakuolära sekvestreringsmembran och en lockliknande struktur som kallas mikropexophagy-specifik membranapparat (MIPA). I makropexofagi uppslukas enskilda peroxisomer av dubbelmembranstrukturer som kallas pexofagosomer, följt av fusion med vakuolen för nedbrytning 8,9,10. Fosforyleringen av pexofagireceptorer, såsom Atg36p i Saccharomyces cerevisiae och Atg30p i Pichia pastoris, är avgörande för receptorerna att rekrytera kärnautofagimaskiner och för att underlätta peroxisomal inriktning mot autofagosomer 8,11.
I däggdjursceller kan pexofagi induceras genom ubiquitination. Märkning av de peroxisomala membranproteinerna PMP34 eller PEX3 med ubiquitin på den cytosoliska sidan inducerar pexofagi12. Överuttryck av PEX3 inducerar peroxisomubiquitinering och peroxisomeliminering av lysosomer13. Dessutom försämrar fusionen av PEX5 med en C-terminal EGFP exporten av monoubiquitinerad PEX5 och resulterar i pexophagy14. Å andra sidan kan pexophagy också utlösas avH2O2-behandling. Peroxisomer producerar reaktiva syreradikaler (ROS); specifikt producerar det peroxisomala enzymet Acox1, som katalyserar det första steget av beta-oxidation av mycket långkedjiga fettsyror (> 22 kol), inte bara acetyl-CoA utan också peroxisomal ROS. Som svar på de ökade ROS-nivåerna underH2O2-behandlingaktiverar däggdjursceller pexofagi för att sänka ROS-produktionen och lindra stress. Det har rapporterats attH2O2-behandlingdriver rekryteringen av ataxi-telangiektasi muterad (ATM) till peroxisomer. ATM fosforylerar sedan PEX5 för att främja peroxisomal omsättning genom pexophagy15.
Eftersom peroxisomer är ROS-genererande centra är de också benägna att ROS-skador. ROS-framkallade peroxisomala skador tvingar celler att aktivera pexofagi för att initiera peroxisomkvalitetskontrollvägar (avlägsnande av den skadade peroxisomen genom autofagi). Här beskriver vi ett tillvägagångssätt för on-demand utlösning av ROS-framkallad peroxisomal skada. Protokollet utnyttjar ljusaktiverad ROS-produktion inom organellerna 16,17,18,19,20 (figur 1). Färgmärkta peroxisomer belyses, vilket leder till ROS-produktion inom peroxisomalt lumen, vilket specifikt utlöser peroxisomal skada. Med hjälp av detta protokoll visas att ROS-stressade peroxisomer avlägsnas genom en ubiquitinberoende nedbrytningsväg. ROS-stressade peroxisomer rekryterar ubiquitin E3-ligaset Stub1 för att tillåta deras uppslukning i autofagosomer för individuellt avlägsnande av pexophagy16. Man kan använda detta protokoll för att jämföra ödet för skadade och friska peroxisomer inom samma cell genom time-lapse-mikroskopi. Metoden kan också användas för att globalt skada alla peroxisomer (i alla celler) på en odlingsskål, vilket möjliggör biokemisk analys av pexofagivägen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Däggdjursceller kan vända peroxisomer genom Stub1-medierad pexofagi. Vägen tillåter potentiellt cellulär kontroll av kvantiteten och kvaliteten på peroxisomer. Under denna process translokerar värmechockprotein 70 och ubiquitin E3-ligaset, Stub1, till peroxisomer som ska vändas för att initiera pexofagi. Stub1-ligasaktiviteten möjliggör ackumulering av ubiquitin och andra autofagirelaterade moduler på riktade peroxisomer. Förhöjning av nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) inom peroxisomalt lumen kan aktivera Stub1-medierad pexofagi. Man kan därför använda färgämnesassisterad ROS-generering för att utlösa och övervaka denna väg. Denna artikel beskriver procedurerna för användning av två klasser av färgämnen, fluorescerande proteiner och syntetiska fluoroforer, för att initiera pexofagi inom däggdjurscellkulturer. Dessa färgämnesassisterade ROS-generationsbaserade protokoll kan inte bara användas för att rikta in sig på alla peroxisomer inom en cellpopulation globalt utan kan också möjliggöra manipulation av enskilda peroxisomer i enskilda celler. Vi beskriver också hur Stub1-medierad pexofagi kan följas med hjälp av levande cellmikroskopi.

Det Stub1-medierade pexophagy induktionsschemat som visas här utnyttjar färgassisterad ROS-generering inom peroxisomlumen. Denna operation kräver minimala ljusintensiteter. Peroxisomer som innehåller fluorescerande proteiner eller färgämnen kan därför belysas med hjälp av vanliga laserscanningskonfokalmikroskop. Fokal belysning leder till momentan och lokal ROS-produktion inom enskilda peroxisomer, vilket indikeras av den fluorescerande reportern roGFP2-VKSKL (figur 9). Vi avbildad...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Detta protokoll innehåller instruktioner för utlösning och övervakning av Stub1-medierad pexofagi i levande celler.

Övervakning av Stub1-medierad pexofagi

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroxisomer utför betaoxidation och är benägna att ROS-skador. Denna metod gör det möjligt att undersöka hur celler hanterar ROS-stressade peroxisomer. Detta protokoll används inte bara för att globalt rikta in sig på alla peroxisomer inom en cellpopulation utan kan också tillåta manipulation av de enskilda peroxisomerna i enskilda celler.Färgassisterad ROS-generering kan också användas för att rikta organeller utanför peroxisomer för att undersöka hur celler hanterar organellskador. Till att börja med, frö två gånger 10 till de femte mänskliga SHSY5Y-cellerna eller sex gånger 10 till den fjärde musen NIH H3T3-celler i 840 mikroliter odlingsmedium på glasbottnade 35-millimeter odlingsskålar med en 20 millimeter diameter glasmikrobrunn. Odla cellerna under 5% koldioxid vid 37 grader Celsius i 24 timmar.Transfektera sedan cellerna med önskade plasmider med hjälp av ett transfektionsreagens eller SHSY5Y-celltransfektion. Späd plasmiderna i 55 mikroliter serumfritt DMEM/F-12 och späd en mikroliter transfektionsreagens i 55 mikroliter serumfritt DMEM/F-12. Kombinera det utspädda DNA:t med det utspädda reagenset.Blanda försiktigt och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Lägg komplexet till 20-millimeters mikrobrunnen som tidigare pläterats med 100 mikroliter odlingsmedium innehållande SHSY5Y-celler utan antibiotika. Skaka försiktigt skålen fram och tillbaka.Utför NIH 3T3-celltransfektion som visats tidigare men ersätt reducerat serummedium istället för serumfritt DMEM / F-12 för plasmidutspädning och transfektionsreagens. Efter två timmars transfektion, avlägsna det transfektionsreagensinnehållande mediet och tillsätt en milliliter färskt odlingsmedium. Inkubera NIH 3T3- eller SHSY5Y-cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar.För ljusaktiverad ROS-produktion, vid 24 timmar efter transfektion, avlägsna odlingsmediet och tillsätt 10 mikroliter 200 nanomolar HaloTag TMR-ligand eller 200 nanomolar Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand på 20-millimeters glasmikrobrunnen. Överför skålen till en inkubator på 37 grader Celsius och 5% koldioxid och låt den stå i en timme för att färga cellerna. Efter en timme, ta bort färgningsmediet noggrant och tillsätt en milliliter färskt odlingsmedium.Placera en glasbottnad skål som innehåller de önskade cellerna på ett laserskanningskonfokalmikroskop utrustat med en sceninkubator. Klicka på Verktygsfönster i programvaran, välj Okulär, och klicka på DIA-knappen för att slå på det överförda ljuset. Visa skålen genom mikroskopokularet och sätt cellerna i fokus genom att vrida på fokusratten.Välj LSM och klicka på knappen Välj färgdetektor. Dubbelklicka på önskade färgämnen i popup-fönstret för att välja lämpliga laser- och filterinställningar för avbildning av cellerna. Klicka på Live4x i Live-panelen för att starta snabb laserskanning för att börja screena för cellernas fluorescerande signaler.Flytta runt scenen med joystickkontrollen och lokalisera mediet diKillerRed VKSKL eller SLP-VKSKL-uttryckande celler för att applicera ROS-stress på peroxisomerna. Skaffa en bild av önskad cell. Klicka på Verktygsfönster och välj LSM-stimulering.Klicka sedan på ellipsknappen och använd musen i Live Image-fönstret för att rita en ROI på 15 mikrometer i diameter som innehåller de önskade peroxisomerna som ROS-spänning kommer att appliceras på. För att applicera ROS-stress, använd 561 nanometer för celler med diKillerRed VKSKL eller TMR-märkt SLP-ligand och använd 640 nanometer för celler färgade med Janelia Fluor 646-märkt SLP-ligand. Välj laservåglängden för applicering av ROS-spänningen.Ange önskad laserprocent och varaktighet. För ROS-produktion i peroxisomerna, klicka på Skaffa och sedan stimuleringsknappen för att initiera skanningen med 561 eller 640 nanometer ljus genom ROI i 30 sekunder vardera. Denna stimulering motsvarar cirka 5% lasereffektinställningar för 561 och 640 nanometer.Efter 30 sekunders laserbelysning förlorar peroxisomer inom ROI sina diKillerRed VKSKL-, TMR- eller Janelia Fluor 646-signaler. Denna signalförlust gör det möjligt att skilja de upplysta och icke-upplysta peroxisomerna i cellen. För att övervaka de pexophagean levande cellerna, följ translokationen av EGFP-märkta Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 eller LC3B till de upplysta eller ROS-stressade peroxisomerna genom tidsfördröjningsavbildning med 10-minuters intervall mellan ramar.Fokal belysning leder till momentan och lokal ROS-produktion inom enskilda peroxisomer som indikeras av den fluorescerande reportern roGFP2-VKSKL. DiKillerRed VKSKL-bilden togs efter att alla roGFP2-VKSKL-mätningar gjordes för att indikera de skadade peroxisomernas plats. Data visar också att obelysta peroxisomer inte påverkas, vilket indikerar metodens precision.Denna metod användes för att övervaka Stub1-medierad pexofagi. Under denna process uppträder Hsp70, Stub1, ubiquitinerade proteiner, autofagiadaptrar p62 och LC3B därefter i ROS-stressade peroxisomer för att driva pexofagi. Med samma strategi var det möjligt att samtidigt skada alla peroxisomer på en odlingsskål för den biokemiska karakteriseringen av Stub1-medierad pexofagi.Före LED-belysning, EGFP-ubiquitinfluorescens var homogen i cytoplasman och samlokaliserade inte med peroxisomerna. Efter nio timmars LED-belysning ackumulerades EGFP-ubiquitinsignalerna på alla peroxisomer i cellerna som odlas i en konfokal skål. Med hjälp av detta protokoll fann vi att ROS-stressade peroxisomer avlägsnas genom en ubiquitinberoende nedbrytningsväg.ROS-stressade peroxisomer rekryterar ubiquitin E3-ligasen Stub1 för att möjliggöra borttagning av pexofagi.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

Funktionell avbildning med armering, Eyetracking och fysiologiska övervakning

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Övervakning växt hormoner under stressreaktioner

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Övervakning Akupunktur Effekter på Human Brain av fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Övervakning av hjärtfunktion i Larvernas Drosophila melanogaster För fysiologiska studier

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Biologiska testsystem för övervakning Insektsmedel Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...