Name: monitoring stub1-mediated pexophagy
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden MOST 111-2311-B-001-019-MY3 araştırma hibesi ile desteklenmiştir.

1. Peroksizom lümeninde diKillerRed veya kendi kendini etiketleyen proteinleri (SLP'ler) eksprese eden hücrelerin hazırlanması
<ol><li>İstenilen hücreleri cam tabanlı hücre kültürü tabaklarına tohumlayın. Buradaki deney için, 840 μL kültür ortamında (DMEM / F-12% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) 2 x 105 insan SHSY5Y hücresini veya 840 μL kültür ortamında (DMEM% 10 sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş...

<ol>
	<li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum.">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).</li><li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+&#946;-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation.">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal &#946;-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li><li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases.">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li><li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+age-related+diseases+and+peroxisomes.">Aging, age-related diseases and peroxisomes.</a> Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).</li><li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li><li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li><li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+is+responsible+for+65%+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders.">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li><li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy+in+yeast+and+mammals:+An+update+on+mysteries.">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li><li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farr&#233;, J. -. C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy.">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li><li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+The+selective+degradation+of+peroxisomes.">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).</li><li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pexophagy:+A+model+for+selective+autophagy.">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).</li><li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes.">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li><li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy.">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts.">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS.">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li><li>Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsc70/Stub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes.">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).</li><li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover.">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111 (2013).</li><li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane.">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells.">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li><li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria.">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428 (2013).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis.">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes.">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li><li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy.">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li></ol>

Bu protokol, peroksizomal ROS seviyelerini ışıkla yükselterek hücre kültürlerinde Stub1 aracılı peksofajinin nasıl tetikleneceğini ayrıntılarıyla açıklar. Protokol boya destekli ROS üretimine dayandığından, ilgili hücreler içinde diKillerRed-VKSKL veya boya etiketli SLP ligand boyamasının yeterli ekspresyonunun sağlanması gerekir. Farklı hücre tiplerinin veya farklı genetik geçmişlere sahip hücrelerin biraz farklı özelliklere sahip peroksizomları barındırabileceği göz önüne alınd...

Peroksizomlar, çoğu ökaryotik hücrede bulunan tek zara bağlı organellerdir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli yağ asitlerinin, pürin katabolizmasının ve eter fosfolipid ve safra asidi sentezinin beta-oksidasyonunu gerçekleştirmek için gerekli metabolik bir bölmedir1. Peroksizom türevi asetil-CoA, metabolizmadaki merkezi sinyalizasyonu düzenleyerek lipid homeostazını kontrol eder2. Bu nedenle, tehlikeye giren peroksizomal fonksiyonların nörodejeneratif bozukluklar, yaşlanma, kanserler, obezite ve diyabet dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda ima edilmesi şaşırtıcı değildir 3,4,5. Peroksizomal operasyonun sürdürülmesinde önemli bir süreç peksofajidir. Pekzofaji, peroksizomların otofaji ile seçici devri için katabolik bir süreçtir. Hücreler, peroksizomların miktarını ve kalitesini kontrol etmeye yardımcı olmak için peksofaji kullanır, böylece uygun peroksizomal fonksiyonu sağlar. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, PEX1 peroksizomal biyogenez faktörleri 1 ve 6'daki mutasyonların neden olduğu peroksizom kaybının kontrolsüz peksofaji6'dan kaynaklandığını göstermiştir. Özellikle, tüm peroksizom biyogenez bozukluğu (PBD) hastalarının% 65'i, memeli hücrelerinde PEX1, PEX6 ve PEX26'dan oluşan peroksizomal AAA ATPaz kompleksinde eksiklikler barındırmaktadır7.
Pekzofajiyi başlatmak ve incelemek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Mayada, sağlanan besinler peroksizoma bağımlı karbon kaynaklarından peroksizomdan bağımsız karbon kaynaklarına (hücresel peroksizom sayılarını düşürmek için) geçtiğinde peksofaji tetiklenir8. Örneğin, metanol tarafından yetiştirilen Pichia pastoris hücrelerinin metanol ortamından glikoz ortamına ve etanol ortamına transferi, sırasıyla 8,9,10 mikropeksofaji ve makropeksofajiyi indükler. Mikropeksofaji sekestörleri, vakuolün fincan benzeri vakuolar sekestrasyon membranları ve mikropekzofajiye özgü membran aparatı (MIPA) olarak adlandırılan kapak benzeri bir yapı oluşturacak şekilde yeniden şekillendirilerek peroksizomları bozunma için kümeledi. Makropeksofajide, bireysel peroksizomlar, peksofagozomlar olarak bilinen çift zarlı yapılar tarafından yutulur, ardından yıkım için vakuol ile füzyon 8,9,10 yapılır. Saccharomyces cerevisiae'deki Atg36p ve Pichia pastoris'teki Atg30p gibi peksofaji reseptörlerinin fosforilasyonu, reseptörlerin çekirdek otofaji makinelerini işe almaları ve otofagozomlara peroksizomal hedeflemeyi kolaylaştırmaları için kritik öneme sahiptir 8,11.
Memeli hücrelerinde, peksofaji ubikitinasyon ile indüklenebilir. Peroksizomal membran proteinleri PMP34 veya PEX3'ün sitozolik tarafta ubikitin ile etiketlenmesi peksofaji12'yi indükler. PEX3'ün aşırı ekspresyonu, lizozomlar13 tarafından peroksizom ubikitinasyonunu ve peroksizom eliminasyonunu indükler. Ek olarak, PEX5'in bir C-terminali EGFP ile füzyonu, monoubikitinlenmiş PEX5'in ihracatını bozar ve peksofaji14 ile sonuçlanır. Öte yandan, peksofajiH2O2tedavisi ile de tetiklenebilir. Peroksizomlar reaktif oksijen türleri (ROS) üretir; Spesifik olarak, çok uzun zincirli yağ asitlerinin (> 22 karbon) beta-oksidasyonunun ilk adımını katalize eden peroksizomal enzim Acox1, sadece asetil-CoA değil, aynı zamanda peroksizomal ROS da üretir. H2O2tedavisi altında artan ROS seviyelerine yanıtolarak, memeli hücreleri ROS üretimini azaltmak ve stresi hafifletmek için peksofajiyi aktive eder. H2O2tedavisinin ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) peroksizomlara alımını yönlendirdiği bildirilmiştir. ATM daha sonra peksofaji15 ile peroksizomal ciroyu teşvik etmek için PEX5'i fosforile eder.
Peroksizomlar ROS üreten merkezler olduğundan, ROS hasarına da eğilimlidirler. ROS kaynaklı peroksizomal yaralanmalar, peroksizom kalite kontrol yollarını başlatmak için hücreleri peksofajiyi aktive etmeye zorlar (hasarlı peroksizomun otofaji ile uzaklaştırılması). Burada, ROS kaynaklı peroksizomal hasarın talep üzerine tetiklenmesi için bir yaklaşım özetliyoruz. Protokol, 16,17,18,19,20 organelleri içinde ışıkla aktive edilen ROS üretiminden yararlanır (Şekil 1). Boya etiketli peroksizomlar aydınlatılır ve peroksizomal lümen içinde ROS üretimine yol açar, bu da özellikle peroksizomal hasarı tetikler. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığı gösterilmiştir. ROS stresli peroksizomlar, ubikitin E3 ligaz Stub1'i, peksofaji16 ile bireysel olarak uzaklaştırılmak üzere otofagozomlara yutulmalarına izin vermek için işe alırlar. Bu protokol, aynı hücre içindeki yaralı ve sağlıklı peroksizomların kaderini hızlandırılmış mikroskopi ile karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (tüm hücrelerde) küresel olarak zarar vermek için de kullanılabilir ve bu da peksofaji yolunun biyokimyasal analizine izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell&#160;</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>20 mm glass bottomed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16170060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diKillerRed-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Hsp70</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-LC3B</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-p62</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Stub1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP-Ub</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&#160; microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GA1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>VitaStar</td>
			<td>PAR64</td>
			<td>80 W, 555-570 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH3T3 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>319850</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP34-TagBFP</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roGFP2-PTS1</td>
			<td>Academia Sinica</td>
			<td></td>
			<td>generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHSY5Y cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td>adherent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring stub1-mediated pexophagy

Memeli hücreleri, Stub1 aracılı peksofaji yoluyla peroksizomları çevirebilir. Yol potansiyel olarak peroksizomların miktarının ve kalitesinin hücresel kontrolüne izin verir. Bu işlem sırasında, ısı şoku proteini 70 ve ubikitin E3 ligaz, Stub1, peksofajiyi başlatmak için döndürülecek peroksizomlar üzerine translokasyona sahiptir. Stub1 ligaz aktivitesi, ubikitin ve diğer otofaji ile ilgili modüllerin hedeflenen peroksizomlarda birikmesine izin verir. Peroksizomal lümen içindeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin yükselmesi, Stub1 aracılı peksofajiyi aktive edebilir. Bu nedenle, bu yolu tetiklemek ve izlemek için boya destekli ROS üretimi kullanılabilir. Bu makalede, memeli hücre kültürlerinde peksofajiyi başlatmak için iki sınıf boya, floresan proteinleri ve sentetik floroforlar kullanma prosedürleri özetlenmektedir. Bu boya destekli ROS üretim tabanlı protokoller, yalnızca küresel olarak bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları hedeflemek için kullanılamaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir. Ayrıca Stub1 aracılı peksofajinin canlı hücre mikroskobu kullanılarak nasıl takip edilebileceğini de açıklıyoruz.

Burada gösterilen Stub1 aracılı peksofaji indüksiyon şeması, peroksizom lümen içindeki boya destekli ROS üretiminden yararlanır. Bu işlem minimum ışık yoğunluğu gerektirir. Bu nedenle, floresan proteinler veya boyalar içeren peroksizomlar, standart lazer taramalı konfokal mikroskoplar kullanılarak aydınlatılabilir. Fokal aydınlatma, floresan muhabir roGFP2-VKSKL tarafından belirtildiği gibi, bireysel peroksizomlar içinde anlık ve lokalize ROS üretimine yol açar (Şekil 9</...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy at JoVE.com

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Bu protokol, canlı hücrelerde Stub1 aracılı peksofajiyi tetiklemek ve izlemek için talimatlar sağlar.

Saplama1 aracılı peksofajinin izlenmesi

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroksizomlar beta oksidasyonunu gerçekleştirir ve ROS hasarına eğilimlidir. Bu yöntem, hücrelerin ROS stresli peroksizomlarla nasıl başa çıktıklarını araştırmaya izin verir. Bu protokol sadece bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları küresel olarak hedeflemek için kullanılmaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir.Boya destekli ROS üretimi, hücrelerin organel yaralanmalarıyla nasıl başa çıktığını araştırmak için peroksizomların dışındaki organelleri hedeflemek için de kullanılabilir. Başlamak için, 20 milimetre çapında cam tabanlı 35 milimetrelik kültür kaplarına 840 mikrolitre kültür ortamında iki kez 10 ila beşinci insan SHSY5Y hücrelerine veya altı kez 10 ila dördüncü fare NIH H3T3 hücrelerine tohum ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında büyütün.Daha sonra, bir transfeksiyon reaktifi veya SHSY5Y hücre transfeksiyonu kullanarak hücreleri istenen plazmidlerle transfekte edin. Plazmidleri 55 mikrolitre serumsuz DMEM/F-12 içinde seyreltin ve bir mikrolitre transfeksiyon reaktifini 55 mikrolitre serumsuz DMEM/F-12 ile seyreltin. Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş reaktif ile birleştirin.Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kompleksi, daha önce antibiyotiksiz SHSY5Y hücreleri içeren 100 mikrolitre kültür ortamı ile kaplanmış 20 milimetrelik mikro kuyucuğa ekleyin. Tabağı yavaşça ileri geri sallayın.Daha önce gösterildiği gibi NIH 3T3 hücre transfeksiyonu gerçekleştirin, ancak plazmid seyreltme ve transfeksiyon reaktifi için serumsuz DMEM / F-12 yerine azaltılmış serum ortamını kullanın. İki saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı çıkarın ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin. NIH 3T3 veya SHSY5Y hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin.Işıkla aktive edilen ROS üretimi için, transfeksiyondan 24 saat sonra kültür ortamını çıkarın ve 20 milimetrelik cam mikro kuyucuğa 10 mikrolitre 200 nanomolar HaloTag TMR ligand veya 200 nanomolar Janelia Fluor 646 HaloTag ligand ekleyin. Çanağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın ve hücreleri boyamak için bir saat bekletin. Bir saat sonra, boyama ortamını iyice çıkarın ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin.İstenilen hücreleri içeren cam tabanlı bir tabağı, bir sahne üstü inkübatör ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskop üzerine yerleştirin. Yazılımda, Araç Penceresi'ne tıklayın, Oküler'i seçin ve iletilen ışığı açmak için DIA düğmesine tıklayın. Çanağı mikroskop göz merceğinden görüntüleyin ve odak düğmesini çevirerek hücreleri odak noktasına getirin.LSM'yi seçin ve Boya Dedektörü Seç düğmesine tıklayın. Hücreleri görüntülemek için uygun lazer ve filtre ayarlarını seçmek için açılır pencerede istediğiniz boyalara çift tıklayın. Hücrelerin floresan sinyallerini taramaya başlamak üzere hızlı lazer taramayı başlatmak için Canlı panelde Live4x'e tıklayın.Joystick kontrol cihazını kullanarak sahneyi hareket ettirin ve peroksizomlara ROS gerilimi uygulamak için orta diKillerRed VKSKL veya SLP-VKSKL eksprese eden hücreleri bulun. İstediğiniz hücrenin görüntüsünü alın. Araç Penceresi'ne tıklayın ve LSM Stimülasyonu'nu seçin.Ardından elips düğmesine tıklayın ve Canlı Görüntü penceresinde, ROS stresinin uygulanacağı istenen peroksizomları içeren 15 mikrometre çapında bir ROI çizmek için fareyi kullanın. ROS stresini uygulamak için, diKillerRed VKSKL veya TMR etiketli SLP ligandına sahip hücreler için 561 nanometre kullanın ve Janelia Fluor 646 etiketli SLP ligandı ile boyanmış hücreler için 640 nanometre kullanın. ROS gerilimini uygulamak için lazer dalga boyunu seçin.İstediğiniz lazer yüzdesini ve süresini girin. Peroksizomlarda ROS üretimi için, her biri 30 saniye boyunca ROI'lerden 561 veya 640 nanometre ışıkla taramayı başlatmak için Acquire ve ardından Stimülasyon düğmesine tıklayın. Bu stimülasyon, 561 ve 640 nanometre için yaklaşık% 5 lazer gücü ayarlarına karşılık gelir.30 saniyelik lazer aydınlatmadan sonra, ROI'lerdeki peroksizomlar diKillerRed VKSKL, TMR veya Janelia Fluor 646 sinyallerini kaybeder. Bu sinyal kaybı, hücre içindeki ışıklı ve ışıksız peroksizomların ayırt edilmesini sağlar. Peksofaj canlı hücrelerini izlemek için, EGFP etiketli Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 veya LC3B'nin, kareler arasında 10 dakikalık aralıklarla hızlandırılmış görüntüleme ile aydınlatılmış veya ROS stresli peroksizomlara translokasyonunu izleyin.Fokal aydınlatma, floresan muhabir roGFP2-VKSKL tarafından belirtildiği gibi bireysel peroksizomlarda anlık ve lokalize ROS üretimine yol açar. diKillerRed VKSKL görüntüsü, hasarlı peroksizomların yerini belirtmek için tüm roGFP2-VKSKL ölçümleri yapıldıktan sonra alındı. Veriler ayrıca, aydınlatılmamış peroksizomların etkilenmediğini ve metodolojinin hassasiyetini gösterdiğini göstermektedir.Bu metodoloji Stub1 aracılı peksofajiyi izlemek için kullanıldı. Bu işlem sırasında, Hsp70, Stub1, ubikitinlenmiş proteinler, otofaji adaptörleri p62 ve LC3B daha sonra peksofajiyi yönlendirmek için ROS stresli peroksizomlarda ortaya çıkar. Aynı stratejiyi kullanarak, Stub1 aracılı peksofajinin biyokimyasal karakterizasyonu için bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara aynı anda zarar vermek mümkündü.LED aydınlatmadan önce, EGFP-ubikitin floresansı sitoplazmada homojendi ve peroksizomlarla kolokalize değildi. Dokuz saatlik LED aydınlatmadan sonra, EGFP-ubikitin sinyalleri, konfokal bir kapta yetiştirilen hücrelerdeki tüm peroksizomlar üzerinde birikti. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığını bulduk.ROS stresli peroksizomlar, peksofaji ile uzaklaştırılmalarına izin vermek için ubikitin E3 ligaz Stub1'i işe alır.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

Takviye, Eyetracking ve Fizyolojik İzleme Fonksiyonel Görüntüleme

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Stres Cevaplarının sırasında Bitki Hormonları İzlenmesi

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

FMRI İnsan Beyninin izlenmesi Akupunktur Etkileri

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...