Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01HL160740 و 5 T32GM132054-04) ومؤسسة فلوريدا لأبحاث القلب. نود أن نشكر كاساندرا غوميز على مساعدتها في تصنيع وتصوير الهلاميات المائية.

تمت الموافقة على العمل في الجسم الحي والإشراف عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة فلوريدا الدولية ويتوافق مع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الحالية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يختلف الإجراء اعتمادا على سلالة الماوس ووزنه وعمره وجنسه. قد يغير نوع ال?...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

عند تنفيذ البروتوكول ، من المهم ملاحظة الخطوات الحاسمة للحصول على نتائج ناجحة. أثناء عزل الشريان الأورطي للفأر ، من الضروري إجراء التروية بشكل صحيح. عند حقن برنامج تلفزيوني ، يجب الحرص على عدم ثقب البطين الأيمن. هذا من شأنه أن يتسبب في تسرب السائل مباشرة من البطين ويفشل في الدوران عبر الرئ?...

التكلس هو أهم مؤشر على الوفيات والمراضة الناجمة عن أمراض القلب والأوعية الدموية1. يغير التكلس ميكانيكا جدار الشرايين بسبب تراكم معادن الكالسيوم والفوسفات2. في تصلب الشرايين ، يمكن أن يؤدي التكلس إلى تفاقم الإجهاد المحلي ويؤدي إلى تمزق البلاك ، وهو السبب الرئيسي للنوبات القلبية. التكلس الإنسي - الناتج غالبا عن مرض الكلى المزمن - أكثر انتشارا ويؤدي إلى تصلب الشرايين بشكل كبير ، واختلال وظيفي ، والحمل الزائد للقلب 2,3. حاليا ، لا توجد خيارات علاجية لعلاج أو الوقاية من تكلس الأوعية الدموية.
تتبنى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) نمطا ظاهريا يشبه بانيات العظم وتطلق حويصلات خارج الخلية متكلسة (EVs) تعمل على نواة المعادن الوليدة ، مما يؤدي إلى تكلس4،5،6. تشبه هذه العملية التمعدن الفسيولوجي لبانيات العظم في العظام7. على الرغم من أن نقطة نهاية التمعدن متشابهة في جدار الأوعية الدموية ومصفوفة العظام ، إلا أن الآليات التي تنشأ بها EVs المتكلسة تختلف في النسجين8. هناك العديد من أنواع النماذج التي تستخدم لدراسة تكلس الأوعية الدموية. في المختبر ، تحاكي نماذج زراعة الخلايا الانتقال العظمي ل VSMCs والتكوين المعدني اللاحق مع وسائط متخصصة.
عند دراسة التكلس في الجسم الحي ، يعتمد النموذج المستخدم على نوع التكلس الذي تتم دراسته. غالبا ما تستخدم نماذج الفئران المفرطة شحميات الدم لدراسة تكلس تصلب الشرايين ، والذي يبدو أكثر تركيزا داخل اللويحات الغنية بالدهون9. في المقابل ، يكون التكلس الإنسي أكثر انتشارا في جميع أنحاء الأوعية الدموية وغالبا ما تتم دراسته باستخدام نماذج أمراض الكلى المزمنة التي تستخدم نظام غذائي غني بالأدينين للحث على الفشل الكلوي أو التقنيات الجراحية لإزالة أجزاء كبيرة من الكلى10,11. استخدمت النماذج العدوانية لتكلس الأوعية الدموية مزيجا من نماذج أمراض الكلى المفرطة في شحميات الدموالمزمنة 12. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكلس الأوعية الدموية في أورتا الفئران لكل من التكلس الإنسي وتصلب الشرايين ، واستخراج EVs من جدار الأبهر ، ومراقبة إمكانات التمعدن في EVs التي تم الحصول عليها من نماذج زراعة الخلايا في المختبر. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه الإجراءات في التحليلات الميكانيكية لتكلس الأوعية الدموية وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم ، وتكلس الأوعية الدموية هو أهم مؤشر على أحداث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا أي علاج أو خيارات علاجية لتكلس الأوعية الدموية. يبدأ التكلس داخل الحويصلات المتخصصة خارج الخلية (EVs) ، والتي تعمل كبؤر نواة عن طريق تجميع أيونات الكالسيوم والفوسفات. يصف هذا البروتوكول طرق الحصول على التكلس وتقييمه في أورتا الفئران وتحليل المركبات الكهربائية المستخرجة المرتبطة بها. أولا ، يتم إجراء تشريح إجمالي للفأر لجمع أي أعضاء ذات صلة ، مثل الكلى والكبد والرئتين. بعد ذلك ، يتم عزل الشريان الأورطي للفأر واستئصاله من جذر الأبهر إلى الشريان الفخذي. ثم يتم تجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا وتحضينها في محلول هضمي قبل الخضوع للطرد المركزي الفائق لعزل المركبات الكهربائية ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تحديد إمكانات التمعدن للمركبات الكهربائية من خلال الحضانة في محلول عالي الفوسفات وقياس امتصاص الضوء بطول موجي يبلغ 340 نانومتر. أخيرا ، يتم استخدام الهلاميات المائية الكولاجين لمراقبة تكوين المعادن المتكلسة والنضج الناتج عن المركبات الكهربائية في المختبر.

بمجرد استخراج الأبهر ، يظهر التصوير باستخدام ماسح ضوئي قريب من الأشعة تحت الحمراء تمثيلا مرئيا للشريان الأورطي بالإضافة إلى تكلس الأوعية الدموية (الشكل 1). تمثل قيم كثافة البكسل داخل الصورة الفلورية الممسوحة ضوئيا توزيع التكلس وتظهر هنا باستخدام خريطة حرارية ملونة. تتضمن ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

يقدم هذا البحث منهجية الحصول على تكلس الأوعية الدموية وتقييمه عن طريق عزل أورتا الفئران متبوعا باستخراج الحويصلات خارج الخلية المتكلسة لمراقبة إمكانات التمعدن.

تحليل تكلس الأوعية الدموية بوساطة الحويصلة خارج الخلية باستخدام نماذج في المختبر وفي الجسم الحي

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة يمكن استخدامها للمساعدة في التقييم ، وفي المستقبل ، المساعدة في تطوير علاجات لتكلس الأوعية الدموية ، وهو أهم مؤشر لأمراض القلب والأوعية الدموية. تسمح لنا القدرة على عزل EVs بإجراء مزيد من الدراسة للآليات التي تؤدي إلى تكلس الأوعية الدموية ، والتغيير الظاهري لخلايا العضلات الملساء الوعائية. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية المبكرة لتكلس الخلايا العضلية الملساء الوعائية.فهم هذا يسمح بدراسة الخيارات العلاجية للآلية المفهومة. يمكن دراسة أي EVs ذات أهمية باستخدام هذه الطريقة. لا يقتصر على خلايا العضلات الملساء الوعائية أو بانيات العظم أو تكلس الأوعية الدموية.بعد القتل الرحيم للفأر ، ارفع الجلد باستخدام الملقط ، وقم بعمل شق أسفل خط الوسط. إزالة أي الجلد الزائد ، أو الدهون. ثم قم بإزالة الأعضاء التناسلية والمثانة والدهون خارج خط الوسط.ثم انقل أعضاء الجهاز الهضمي إلى الجانب الأيمن واتبع الأمعاء في خط الوسط. بمجرد العثور عليها ، ارفع خط الوسط ، واستأصل الجهاز الهضمي حتى المعدة. استئصال الكلى عن طريق رفعها بعيدا عن خط الوسط.قطع بالقرب من الكلى قدر الإمكان. إزالة الكبد عن طريق رفع الفصوص وقطع بعيدا عن خط الوسط. ثم قم ببث القلب والشريان الأورطي عن طريق حقن برنامج تلفزيوني بارد في البطين الأيمن باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر.انتظر حتى تنتفخ الرئتان وتتحول إلى اللون الأبيض. إزالة الرئتين وأي الحجاب الحاجز الزائد ، أو القفص الصدري. لإزالة العظم ، افتح مقصا عريضا وضعه في المنطقة السفلية من الماوس فوق الذيل.قطع لأسفل ، ورفع العمود الفقري من الجلد ، وإزالة الدهون من جانبي خط الوسط. بمجرد فصل الجلد ، قم باستئصال العمود الفقري والأعضاء السليمة عن طريق القطع فوق القلب مباشرة. ضع العمود الفقري والأعضاء السليمة في دورق من PBS في دلو الثلج إذا تم نقله إلى مجسم.بعد تحريك العمود الفقري والأعضاء إلى طبق التشريح ، املأه بالثلج البارد PBS ، وقم بتثبيت العمود الفقري والقفص الصدري باستخدام الإبر. تحت مجهر التشريح ، ارفع القلب بعناية باستخدام الملقط ، وابدأ في القطع فوق العمود الفقري وتحت الشريان الأورطي. استمر في هذا حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من العمود الفقري.قم بإزالة العمود الفقري من طبق التشريح ، وقم بتثبيت القلب وأي دهون أو عضلات غريبة. بدءا من المنطقة الواقعة أسفل القلب مباشرة ، حدد المريء والوريد الأجوف والشريان الأورطي. قم بإزالة المريء والوريد الأجوف للحصول على مجال بصري واضح للشريان الأورطي.باستخدام ملقط ومقص التشريح الدقيق ، ابدأ في رفع الأنسجة الدهنية ، وقطع أقرب ما يمكن إلى الشريان الأورطي. استمر في ذلك أسفل الخط الإنسي حتى تنكشف جميع الشريان الأورطي والشرايين الفخذية. في القلب ، قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية التي تعرض الفروع الثلاثة في قوس الأبهر.قم بإزالة جذر الأبهر من البطين الأيسر عن طريق إدخال مقص التشريح الدقيق في البطين الأيسر ، وقطع العضلات المحيطة بالشريان الأورطي. بمجرد عزل الشريان الأورطي وتنظيفه ، قم بتصوير الشريان الأورطي باستخدام ماسح ضوئي قريب من الأشعة تحت الحمراء لتصور تكلس الأوعية الدموية. باستخدام البرنامج النصي MATLAB المخصص ، حدد الإشارة الإجمالية لمقتفي الكالسيوم الطبيعي إلى إجمالي منطقة الشريان الأورطي الممسوحة ضوئيا.قم بتوجيه MATLAB إلى موقع ملفات TIF من المسح بالأشعة تحت الحمراء القريبة من الشريان الأورطي ، وافتح الملفات الفردية ، واستخرج قيم كثافة البكسل من ملفات TIF. حدد الشريان الأورطي ذو التكلس الأكبر كأقصى مقياس على الصورة المعينة بالألوان. عندما يظهر الأمر ، كم عدد العينات الموجودة في الصورة ، على النافذة ، أدخل عدد الأبهر في الصورة الحالية ، وحدد كل شريان أورطي واحدا تلو الآخر.بمجرد اختيار الشريان الأورطي ، سيقوم MATLAB بإنشاء صور ثنائية مع قناع للمساحة الكلية والمنطقة المتكلسة من الشريان الأورطي. ثم يتم استخدام القيم من هذه الصور المقنعة لتحديد إجمالي المساحة المتكلسة ، والمساحة الكلية للشريان الأورطي ، والنسبة المئوية للمساحة الموجبة للتكلس ، ومتوسط شدة المنطقة المتكلسة. مباشرة بعد مسح الشريان الأورطي ، قم بتجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا لإنتاج تركيز كاف من البروتين.احتضان اثنين إلى ثلاثة من الأبهر المجمع في 1.5 ملليلتر من محلول الهضم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. جمع الحل وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 غرام لمدة 15 دقيقة لإزالة حطام الخلية. بعد ذلك ، لإزالة الحويصلات الدقيقة ، قم بطرد المادة الطافية مرة أخرى لمدة 30 دقيقة عند 33،000 جم.جمع وتقييم الطافية لإمكانية التكلس. بعد إزالة حطام الخلية من الوسط المجمعة المشروط عن طريق الطرد المركزي ، قم بتدوير المادة الطافية المجمعة عند 33،000 جم لمدة 30 دقيقة. جمع طاف ونقله إلى أنبوب جديد.ثم أضف 1٪ من 300 مليمول فوسفات هيدروجين الصوديوم إلى عينات الحويصلة خارج الخلية ، واخلط المحلول عن طريق الماصة. انقل 200 ميكرولتر من محلول الخليط إلى صفيحة 96 بئرا ، واحتضن الصفيحة المكونة من 96 بئرا في قارئ الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية. اضبط قارئ اللوحة لتسجيل الامتصاص بطول موجي يبلغ 340 نانومتر كل دقيقة واحدة.ماصة 300 ميكرولتر من محلول الكولاجين في كل بئر من زجاج من ثماني آبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من DMEM كعنصر تحكم في الآبار. أضف 300 ميكرولتر من عينات وسط الحويصلة خارج الخلية التي تم جمعها مسبقا إلى الآبار المتبقية ، واحتضانها لمدة ستة أيام ، كما هو موضح سابقا.في اليوم العاشر ، ماصة 2.5 ميكرولتر من خليط OsteoSense و DMEM في كل بئر ، واحتضانها لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة ، قم بتصوير الهلاميات المائية مع مرشحات لمضان OsteoSense من خلال الجزء السفلي من غرفة الغطاء الزجاجي باستخدام مجهر مقلوب ، أو من الأعلى بهدف مسافة عمل طويلة. قم بتقييم عدد التكلسات وحجم التكلس والصور التي تم جمعها باستخدام خيارات تحليل الجسيمات المتاحة في ImageJ.ثم انتقل إلى الصورة، وحدد ضبط، وانقر فوق عتبة لتدوين الصور، بحيث تظهر إشارة OsteoSense فقط باللون الأبيض. ثم استخدم أمر تحليل، وانقر تحليل الجسيمات للحصول على معلومات لكل تكلس في الصورة. استخدم نفس معلمات العتبة للتناسق لكل صورة تم تحليلها.أظهر التصوير بالماسح الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة من الأورتا التي تم تشريحها إشارة OsteoSense أعلى في جميع أنحاء الشريان الأورطي للفأر المصاب بمرض الكلى المزمن من اثنين من الأورتا من الفئران الضابطة. أظهر الوسط المكيف الذي تم الحصول عليه من خلايا العضلات الملساء الوعائية المزروعة في وسط مؤيد للتكلس امتصاصا أعلى عند 340 نانومتر من وسط التحكم. حدثت زيادة الامتصاص أسرع بمقدار 1.5 مرة في العينة المؤيدة للتكلس مقارنة بعينة التحكم.احتوى الوسط المكيف من الخلايا المستزرعة في ظروف مؤيدة للتكلس على رواسب معدنية. عند التشريح الدقيق للشريان الأورطي ، من المهم قطع الدهون المحيطة بالشريان الأورطي بعناية. تريد تحليل أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي ، لكن هذا قد يكون مملا للغاية.بمجرد عزل المركبات الكهربائية ، يمكن إكمال اختبارات إضافية ، مثل فحص نشاط الفوسفاتيز القلوي ، أو الجسم المناعي. ستظهر هذه الاختبارات أيضا الآليات والبروتينات الموجودة في المركبات الكهربائية.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

في الجسم الحي والدراسات في المختبر من محول - clathrin التفاعل

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...