Name: analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Heart, Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 og 5 T32GM132054-04) og Florida Heart Research Foundation. Vi vil gerne takke Kassandra Gomez for hendes hjælp med at syntetisere og billeddannelse af hydrogelerne.

In vivo-arbejdet blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Florida International University og overholdt de nuværende retningslinjer fra National Institutes of Health (NIH). For denne protokol varierer proceduren ikke afhængigt af musens stamme, vægt, alder og køn. Den type forkalkning, der undersøges, diæter og behandlinger kan ændre undersøgelsens længde og vægten af den anvendte mus og kan være afhængig af en bestemt stamme og køn af mus, der anvendes ...

<ol>
	<li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification.">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).</li><li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+arterial+calcification:+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease.">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li><li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li><li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li><li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo.">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601 (2020).</li><li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification:+Current+controversies+and+novel+concepts.">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li><li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization:+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification.">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li><li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).</li><li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis:+A+review+of+findings+to+date.">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li><li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD:+A+review.">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li><li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice:+role+of+serum+phosphorus,+fibroblast+growth+factor-23,+and+osteopontin.">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li><li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease.">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li><li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles.">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li></ol>

Når du udfører protokollen, er det vigtigt at bemærke de kritiske trin for at opnå vellykkede resultater. Under isoleringen af murine aorta er det vigtigt, at perfusionen udføres korrekt. Ved injektion af PBS skal man passe på ikke at punktere højre ventrikel. Dette ville medføre, at væsken lækker direkte ud af ventriklen og undlader at cirkulere gennem lungerne og efterlader blod i aorta. Når perfusionen er udført korrekt, og mikrodissektion er begyndt, skal alt fedt- og fedtvæv fjernes fra aorta før afslu...

Forkalkning er den mest betydningsfulde prædiktor for dødelighed og sygelighed i hjerte-kar-sygdomme1. Forkalkning ændrer arterievægsmekanikken på grund af opbygningen af calcium- og fosfatmineraler2. I åreforkalkning kan forkalkning forværre lokal stress og resultere i plaquebrud, som er den største årsag til hjerteanfald. Medial forkalkning - ofte som følge af kronisk nyresygdom - er mere udbredt og fører til betydelig arteriel afstivning, dysfunktion og hjerteoverbelastning 2,3. I øjeblikket er der ingen terapeutiske muligheder for behandling eller forebyggelse af vaskulær forkalkning.
Vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) vedtager en osteoblastlignende fænotype og frigiver forkalkende ekstracellulære vesikler (EV'er), der nukleerer spirende mineraler og dermed driver forkalkning 4,5,6. Denne proces ligner den fysiologiske mineralisering af osteoblaster i knogle7. Selvom mineraliseringens endepunkt er ens i vaskulærvæggen og knoglematrixen, er de mekanismer, hvormed de forkalkende EV'er stammer fra, forskellige i de to væv8. Der er mange typer modeller, der bruges til at studere vaskulær forkalkning. In vitro efterligner cellekulturmodeller den osteogene overgang af VSMC'er og efterfølgende mineraldannelse med specialiserede medier.
Når man studerer in vivo-forkalkning, afhænger den anvendte model af den type forkalkning, der undersøges. Hyperlipidemiske musemodeller bruges ofte til at studere aterosklerotisk forkalkning, som forekommer mere fokal inden for lipidrige plaques9. I modsætning hertil er medial forkalkning mere udbredt i hele vaskulaturen og studeres ofte ved hjælp af kroniske nyresygdomsmodeller, der anvender et adeninrigt diætregime til at fremkalde nyresvigt eller kirurgiske teknikker til at fjerne betydelige dele af nyrerne10,11. Aggressive modeller af vaskulær forkalkning har brugt en kombination af både hyperlipidemiske og kroniske nyresygdomsmodeller12. Denne protokol tilvejebringer en metode til vurdering af vaskulær forkalkning i murine aortas for både medial og aterosklerotisk forkalkning, ekstraktion af EV'er fra aortavæggen og observation af mineraliseringspotentialet i EV'erne opnået fra in vitro-cellekulturmodeller. Fremtidige undersøgelser kan bruge disse procedurer i mekanistiske analyser af vaskulær forkalkning og til at vurdere potentielle terapeutiske interventioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 inch Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pan and Wax</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>DSPA01-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>DLx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)&#160;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B11229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680EX</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A4782602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>TPIN02-PK/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fischer Chemical</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of extracellular vesicle-mediated vascular calcification using in vitro and in vivo models

Kardiovaskulær sygdom er den største dødsårsag i verden, og vaskulær forkalkning er den mest betydningsfulde forudsigelse for kardiovaskulære hændelser; Der er dog i øjeblikket ingen behandling eller terapeutiske muligheder for vaskulær forkalkning. Forkalkning begynder inden for specialiserede ekstracellulære vesikler (EV'er), der tjener som nukleerende foci ved at aggregere calcium- og fosfationer. Denne protokol beskriver metoder til opnåelse og vurdering af forkalkning i murine aortas og analyse af de tilhørende ekstraherede EV'er. For det første udføres grov dissektion af musen for at indsamle relevante organer, såsom nyrer, lever og lunger. Derefter isoleres murine aorta og udskæres fra aortaroten til lårbensarterien. To til tre aortaer samles derefter og inkuberes i en fordøjelsesopløsning, inden de gennemgår ultracentrifugering for at isolere de interessante elbiler. Dernæst bestemmes EV'ernes mineraliseringspotentiale ved inkubation i en højfosfatopløsning og måling af lysabsorbansen ved en bølgelængde på 340 nm. Endelig bruges kollagenhydrogeler til at observere den forkalkede mineraldannelse og modning, der produceres af EV'erne in vitro.

Når aortas er ekstraheret, viser billeddannelse ved hjælp af en nær-infrarød optisk scanner en visuel repræsentation af aorta såvel som vaskulær forkalkning (figur 1). Pixelintensitetsværdierne i det scannede fluorescerende billede repræsenterer fordelingen af forkalkning og vises her ved hjælp af et farvet varmekort. Kvantificeringsmetoder omfatter identifikation af en positiv tærskel og rapportering af det procentvise areal af aorta med værdier større end denne tærskelværdi ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models at JoVE.com

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Dette papir præsenterer metoden til opnåelse og vurdering af vaskulær forkalkning ved isolering af murine aortas efterfulgt af ekstraktion af forkalkede ekstracellulære vesikler for at observere mineraliseringspotentialet.

Analyse af ekstracellulær vesikelmedieret vaskulær forkalkning ved hjælp af in vitro- og in vivo-modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Denne protokol giver en metode, der kan bruges til at hjælpe med at vurdere og i fremtiden hjælpe med at udvikle behandlinger for vaskulær forkalkning, som er den mest betydningsfulde forudsigelse for hjerte-kar-sygdomme. Evnen til at isolere elbiler giver os mulighed for yderligere at studere de mekanismer, der fører til vaskulær forkalkning, og den fænotypiske ændring af vaskulære glatte muskelceller. Denne teknik giver indsigt i tidlige molekylære mekanismer af vaskulær glat muskelcellemedieret forkalkning.Forståelse af dette gør det muligt at undersøge terapeutiske muligheder for den forståede mekanisme. Alle elbiler af interesse kan studeres ved hjælp af denne metode. Det er ikke eksklusivt for vaskulære glatte muskelceller, osteoblaster eller vaskulær forkalkning.Efter aflivning af musen skal du løfte huden ved hjælp af pincet og lave et snit ned ad midterlinjen. Fjern overskydende hud eller fedt. Fjern derefter reproduktive organer, blære og fedt uden for midterlinjen.Flyt derefter mave-tarmorganerne til højre side og følg tarmene i midterlinjen. Når den er fundet, løft midterlinjen og punktafgifter mave-tarmkanalen op til maven. Punktafgifter nyrerne ved at løfte dem væk fra midterlinjen.Skær så tæt på nyrerne som muligt. Fjern leveren ved at løfte lapperne og skære væk fra midterlinjen. Derefter perfusere hjertet og aorta ved at injicere kold PBS i højre ventrikel ved hjælp af en 10 ml sprøjte.Vent til lungerne blæser op, og bliver hvide. Fjern lungerne og overskydende membran eller brystkasse. For at fjerne knoglen skal du åbne en saks bred og placere dem i det nederste område af musen over halen.Skær nedad, løft rygsøjlen fra huden, og fjern fedtet fra siderne af midterlinjen. Når huden er løsnet, punktafgifter rygsøjlen og intakte organer ved at skære lige over hjertet. Placer rygsøjlen og intakte organer i et bægerglas PBS i isspanden, hvis de transporteres til et stereoskop.Når du har flyttet rygsøjlen og organerne ind i dissekeringsskålen, skal du fylde den med iskold PBS og fastgøre rygsøjlen og brystkassen ved hjælp af nåle. Under dissektionsmikroskopet løfter hjertet forsigtigt ved hjælp af pincet, og begynder at skære over rygsøjlen og under aorta. Fortsæt dette, indtil bunden af rygsøjlen er nået.Fjern rygsøjlen fra dissekeringsskålen, og fastgør hjertet og eventuelt fremmed fedt eller muskler. Start fra området lige under hjertet, identificer spiserøret, vena cava og aorta. Fjern spiserøret og vena cava for at få et klart synsfelt af aorta.Brug mikrodissektionspincet og saks til at løfte fedtvævet og skære så tæt på aorta som muligt. Fortsæt dette ned ad mediallinjen, indtil alle aorta og lårbensarterierne er udsat. I hjertet skal du fjerne alt fedtvæv, der udsætter de tre grene ved aortabuen.Fjern aortriden fra venstre ventrikel ved at indsætte mikrodissektionssaksen i venstre ventrikel og skære musklen omkring aorta. Når aorta er isoleret og renset, skal du afbilde aorta ved hjælp af en nær-infrarød scanner til at visualisere vaskulær forkalkning. Brug det brugerdefinerede MATLAB-script til at kvantificere det samlede signal fra calciumsporstoffet normaliseret til det samlede scannede aortaområde.Diriger MATLAB til placeringen af TIF-filerne fra den nær-infrarøde scanning af aortas, åbn de enkelte filer, og udpak pixelintensitetsværdierne fra TIF-filerne. Vælg aorta med den største forkalkning som skalamaksimum på det farvekortlagte billede. Når kommandoen, Hvor mange prøver er der på billedet, vises i vinduet, skal du indtaste antallet af aortas i det aktuelle billede og vælge hver aorta en efter en.Når en aorta er valgt, opretter MATLAB binære billeder med en maske af det samlede areal og det forkalkede område af aorta. Værdierne fra disse maskerede billeder bruges derefter til at bestemme det samlede forkalkede areal, det samlede areal af aorta, det procentvise areal, der er positivt for forkalkning, og den gennemsnitlige intensitet af det forkalkede område. Umiddelbart efter scanning af aortas samles to til tre aortas for at give en tilstrækkelig proteinkoncentration.Inkuber to til tre poolede aortas i 1,5 ml fordøjelsesopløsning i to timer ved 37 grader Celsius. Saml opløsningen og centrifuger ved 1.000 g i 15 minutter for at fjerne celleaffald. For at fjerne mikrovesiklerne centrifugeres supernatanten igen i 30 minutter ved 33.000 g.Supernatanten indsamles og vurderes med hensyn til forkalkningspotentiale. Efter fjernelse af cellerester fra det konditionerede opsamlede substrat ved centrifugering drejes den opsamlede supernatant ved 33.000 g i 30 minutter. Supernatanten opsamles og overføres til et nyt glas.Derefter tilsættes 1% af 300 millimolært natriumdihydrogenphosphat til de ekstracellulære vesikelprøver, og opløsningen blandes ved pipettering. Overfør 200 mikroliter af blandingsopløsningen til en 96-brøndplade, og inkuber 96-brøndpladen i mikropladelæseren ved 37 grader Celsius. Indstil pladelæseren til at registrere absorbansen ved en bølgelængde på 340 nanometer hvert minut.Pipette 300 mikroliter kollagenopløsningen i hver brønd i et otte-brønds kammerglas og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 72 timer. Efter inkubationen tilsættes 300 mikroliter DMEM som en kontrol i brøndene. Tilsæt 300 mikroliter af de ekstracellulære vesikelmediumprøver, der tidligere er indsamlet til de resterende brønde, og inkuber i seks dage, som vist tidligere.På den 10. dag pipetteres 2,5 mikroliter af OsteoSense- og DMEM-blandingen i hver brønd og inkuberes i 24 timer. Ved afslutningen af inkubationen afbildes hydrogelerne med filtre for OsteoSense-fluorescens gennem bunden af et dækglaskammer ved hjælp af et omvendt mikroskop eller fra toppen med et mål om lang arbejdsafstand. Vurder antallet af forkalkninger og forkalkningsstørrelsen og de indsamlede billeder ved hjælp af de partikelanalysemuligheder, der er tilgængelige i ImageJ.Gå derefter til Billede, vælg Juster, og klik på Tærskel for at binarisere billederne, så kun OsteoSense-signalet vises hvidt. Brug derefter kommandoen Analysér, og klik på Analysér partikler for at få oplysninger om hver forkalkning i billedet. Brug de samme tærskelparametre for konsistens for hvert analyseret billede.Nær-infrarød optisk scannerbilleddannelse af de dissekerede aortas viste et højere OsteoSense-signal i hele aorta hos en mus med kronisk nyresygdom end de to aortaer fra kontrolmus. Det konditionerede medium opnået fra vaskulære glatte muskelceller dyrket i et pro-kalcific medium viste en højere absorbans ved 340 nanometer end kontrolmediet. Absorbansforøgelsen forekom 1,5 gange hurtigere i den pro-kalcificiske prøve sammenlignet med en kontrolprøve.Det konditionerede medium fra celler dyrket under pro-kalcifiske forhold indeholdt mineralaflejringer. Når du mikrodissekerer aorta, er det vigtigt at skære fedtet omkring aorta omhyggeligt. Du vil have så meget af aorta som muligt at analysere, men det kan være ret kedeligt.Når elbiler er isoleret, kan yderligere tests, såsom et alkalisk fosfataseaktivitetsassay eller immunlegeme, afsluttes. Disse tests vil yderligere vise de mekanismer og proteiner, der findes i elbiler.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryopræservering og Recovery bruger I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro-syntese af modificeret mRNA for Induktion af protein-ekspression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fænotyper teknikker af majs kardiovaskulære bundter baseret på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse af E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...